研究背景:直肠癌是我国发病率第四,致死率第五的恶性肿瘤,严重威胁着人民健康。术前新辅助同步放化疗(NCCRT)联合根治性直肠切除术是局部晚期直肠癌(LARC)的标准治疗方法,然而只有约15%-27%的患者能达到病理完全缓解。若能筛选出达到病理完全缓解的患者进入“观察和等待”,就可规避手术可能带来的创伤和过度治疗。因此如何找到较好预测新辅助疗效的无创性指标,成为临床亟待解决的问题。菌群作为近年来的研究热点,粪菌移植和益生菌制剂均展现出了很好的临床前景。人体-菌群共生生态系统的平衡对于维持人体稳态和健康极为重要,当平衡被打破时,菌群紊乱与肿瘤,心血管疾病,认知精神类疾病,免疫炎症性疾病等的相关研究被大量报道。甚至有观点认为,结直肠癌不仅可看成是一种遗传病,也可被看作是一种微生物疾病。肠道菌群产生代谢物和细菌毒素,通过影响细胞增殖,调节炎症和免疫,诱导DNA损伤等多方面参与调控了消化道肿瘤的发生发展,更是影响治疗疗效和预后的重要因素。目前未见直肠癌NCCRT对肠道菌群的重塑作用以及肠道菌群与放化疗敏感性的系统研究。放化疗除外直接诱导DNA损伤还可通过调节免疫来发挥抗肿瘤效应,探究直肠癌NCCRT中系统免疫炎症相关性指标的变化特征有利于加深对NCCRT作用机制的理解。根据以上背景,我们通过动态采集接受新辅助同步放化疗的LARC患者治疗前,治疗中,治疗后3个临床采样时间点的粪便样本,以及后续患者手术时的新鲜肿瘤组织样本和癌旁组织样本,进行16s rRNA V4区域二代高通量测序。探究NCCRT对于菌群的重塑作用,并筛选出不同新辅助治疗疗效的患者之间的差异菌属,为研究菌群和放化疗敏感性提供一定依据。我们在相同的3个时间点同时收集了患者的外周血样本检测sCTLA4,sPD1,sPD-L1,sLAG3等可溶性循环免疫调节蛋白的表达水平,比较PLR,NLR,SII等系统炎症性指标在新辅助治疗中的变化趋势,并进一步探讨了上述机体免疫炎症相关性指标与NCCRT治疗疗效的关联性。同时,我们还检测了 NCCRT治疗前的肿瘤活检组织与NCCRT治疗结束后的手术肿瘤组织中局部多种不同亚型的淋巴细胞的密度,从多维度探讨了 NCCRT对局部和全身免疫炎症状态的调节作用。此外,本研究还探索性分析了 NCCRT中差异菌属与机体免疫炎症相关性指标的相关性,为后续的临床和基础研究提供一定依据。第一部分 直肠癌新辅助放化疗重塑肠道菌群影响治疗疗效研究目的:探究新辅助同步放化疗对局部晚期直肠癌患者的肠道菌群及肿瘤内菌群的重塑作用;筛选出不同新辅助疗效患者中的差异菌属,为研究菌群和放化疗敏感性提供一定依据,以期找到较好预测新辅助治疗疗效的新型生物标记物。材料与方法:本研究共入组了 39名接受标准NCCRT的LARC患者,采集患者接受新辅助治疗前,治疗中期,治疗结束后3个临床时间点的粪便样本,以及后续患者进行直肠癌根治切除术时的新鲜肿瘤组织样本和癌旁组织样本,对粪便样本和组织样本进行16s rRNA V4区域的二代高通量测序,通过生物信息学分析,探讨NCCRT对LARC患者肠道菌群和肿瘤内菌群的重塑作用,并筛选出不同新辅助疗效患者间的差异菌属。结果:1.LARC患者在接受NCCRT过程中,肠道菌群的多样性显著降低(p=0.01),丰度稍有降低但未见显著差异,而肿瘤组织与癌旁组织菌群多样性相近。2.NCCRT疗效较好分组的患者在接受新辅助治疗的过程里总体有着更高的肠道菌群丰度(p=0.0347)。3.在门水平上,新辅助治疗过程里厚壁菌门Firmicutes/拟杆菌门Bacteroide tes逐渐升高。在属水平上,治疗后梭杆菌属Fusobacterium,微单胞菌属Parvimonas,狭小梭菌属Clostridium_sensu_stricto的占比对比治疗前显著降低(p<0.001)。肿瘤组织与癌旁组织菌群组成则未见显著差异。4.新辅助治疗结束后,疗效较好的患者中狭小梭菌属Clostridium_sensu_stricto,梭杆菌属Fusobacterium,瘤胃球菌 Ruminococcus,梭菌属 Ⅳ Clostridium_Ⅳ,颤杆菌属Oscillibacter,梭菌属 XlVb Clostridium_XlVb,粪杆菌属Faecalibacterium,肠杆菌属 Enterobacter 的丰度显著低于疗效较差患者组(p<0.05)。5.接受新辅助治疗后,瘤胃球菌Ruminoccus,梭菌属Ⅳ Clostridium Ⅳ,颤杆菌属Oscillibacter,梭菌属 XlVb Clostridium_XlVb,粪杆菌属Faecalibacterium,肠杆菌属Enterobacter在疗效较好患者组中相比治疗前均显著降低(p<0.05),而在疗效较差组相比治疗前丰度增加。结论:1.NCCRT治疗过程显著降低了 LARC患者的肠道菌群多样性,改变了肠道菌群的构成及丰度,对肠道菌群有重塑作用。2.NCCRT疗效较好的患者在新辅助治疗里总体有着更高的肠道菌群丰度。3.NCCRT结束后,部分菌属与新辅助治疗的疗效相关:NCCRT在不同疗效患者间对肠菌的塑造作用显示出差异性,分属于厚壁菌门梭菌纲,梭杆菌门梭杆菌纲以及变形菌门丙型变形菌纲的8种菌属可能参与影响了直肠癌NCCRT的疗效。第二部分 直肠癌新辅助放化疗调控系统免疫炎症性指标及其与肠道菌群的相关性研究目的:探究LARC患者接受新辅助同步放化疗过程里PLR,NLR,SII等系统炎症性指标和sCTLA4,sPD1,sPD-L1,sLAG3等循环免疫调节蛋白的变化趋势;归纳不同新辅助疗效的患者间系统免疫炎症相关性指标变化特征的差异性;比较NCCRT治疗前后肿瘤局部不同亚型淋巴细胞浸润特征;探索性分析差异性肠道菌属与系统免疫炎症相关性指标的相关性。材料与方法:本研究入组了 39名接受NCCRT的LARC患者,采集患者NCCRT治疗前,治疗中,治疗后3个临床时间点的外周血液样本,检测NCCRT过程里可溶性免疫调节蛋白sCTLA4,sPD1,sPD-L1,sLAG3的表达水平,以及基于血常规分析计算出全身炎症性指标PLR,NLR,SII的值,通过免疫组织化学染色比较了 NCCRT治疗前后肿瘤局部淋巴细胞浸润特征。探讨NCCRT对系统免疫和炎症性相关指标的影响,以及归纳不同NCCRT疗效患者间的差异性变化特征,并探索性分析了不同NCCRT疗效患者间系统免疫及炎症相关性指标与差异性肠道菌属的相关性。结果:1.NCCRT治疗中,治疗后相较于治疗前,系统炎症性指标PLR,NLR,SII均显著增高(p<0.001),且PLR,NLR,SII的增高在NCCRT治疗的前半程最为显著(p<0.001),在治疗的后半程保持稳定。2.不同NCCRT疗效患者中PLR,NLR,SII的表达水平未见显著性差异,且变化趋势一致,在NCCRT治疗的前半程显著升高(p<0.001),在治疗后半程保持稳定。3.可溶性免疫调节蛋白sCTLA4,sPD1,sPDL1,sLAG3的分泌在NCCRT治疗的前半程显著降低(p<0.001),后半程大幅回升至接近基线水平。4.不同NCCRT疗效患者中sCTLA4,sPD1,sPDL1,sLAG3的分泌水平未见显著性差异,但在不同NCCRT疗效的患者中表现出不一致的变化趋势,治疗前半程循环免疫调节蛋白显著降低的患者NCCRT疗效更好。5.疗效较好的患者组可溶性免疫调节蛋白sCTLA4,sPD1,sPDL1,sLAG3的变化趋势与整体趋势一致,在治疗的前半程显著降低(p<0.001),后半程大幅回升至接近基线水平。而疗效较差分组的患者在NCCRT治疗里可溶性免疫调节蛋白的表达趋于稳定。6.新辅助治疗后肿瘤组织标本中PD-1、PD-L1、Foxp3等表达较治疗前活检肿瘤组织标本中更低;疗效较好的患者高表达PD-1,疗效较差患者高表达Foxp3,然而受限于样本数,统计效能较弱,以上趋势并未达统计学显著差异(p>0.05)。7.相关性分析显示新辅助治疗中,sCTLA4,sPD1,sLAG3与梭杆菌属Fusobacterium丰度成正相关,与粪杆菌属Faecalibacterium,Alistipes和瘤胃球菌2Rumicoccus2的丰度成负相关(p<0.05,未校正)。结论:1.NCCRT过程升高了 LARC患者系统性炎症水平,在不同NCCRT疗效的患者中PLR,NLR,SII的变化趋势一致,均在新辅助治疗前半程中显著性升高,而在治疗后半程趋于稳定。2.在NCCRT治疗前半程中可溶性循环免疫调节蛋白sCTLA4,sPD1,sPD-L1,sLAG3的分泌水平显著降低的患者对NCCRT治疗的敏感性更高,疗效更好。3.新辅助治疗中,循环免疫调节蛋白的表达水平与若干肠道菌群的丰度显著相关。sCTLA4,sPD1,sLAG3的表达与粪便梭杆菌属Fusobacterium丰度成正相关,与粪杆菌属Faecalibac Alistipes和瘤胃球菌2 的丰度成负相关。课题的创新性和局限性课题的创新性1.本研究通过对比直肠癌新辅助治疗不同疗效患者间的肠道菌群,挖掘了和不同新辅助疗效相关的差异菌属,为研究菌群和放化疗敏感性以及寻找无创临床靶标提供一定依据。2.本研究通过对新辅助治疗过程中的肠道菌群进行多点监测,阐明了肠道菌群在直肠癌新辅助治疗过程中的菌群多样性,构成及丰度变化特征,为明确新辅助治疗对肠道菌群的重塑作用提供依据。3.本研究探究了直肠癌新辅助治疗过程中系统炎症性指标和循环免疫调节蛋白的动态变化趋势及其在不同治疗疗效患者中的特征性变化,比较了 NCCRT治疗前后肿瘤局部不同亚型的淋巴细胞浸润特征,加深了对于NCCRT免疫调节作用机制的理解,并探索性分析了差异菌属与外周免疫指标的相关性。课题的局限性1.本研究虽然对治疗多点动态监测,但是入组人数相对较少,下一步需要继续扩大样本量进一步验证。2.新辅助治疗疗效评价指标单一,只有患者的近期疗效(病理完全缓解),没有患者的复发,生存等数据,下一步需要对入组患者进行长期随访。3.本研究只探究性分析了差异菌属与系统免疫指标的相关性,并未对机制进行深入探讨,下一步应建立动物模型,细胞实验来进一步验证筛选出的差异菌属是如何影响新辅助疗效的机制研究。