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研究背景代谢综合征(metabolic syndrome,MS)的发病率在全球范围内逐年上升,对当今世界人类健康造成了极大威胁。其中,肥胖衍生的胰岛素抵抗(ins ulin resistance,IR)是代谢性疾病的主要特征。双酚A(Bisphenol A,BPA)作为一种广泛生产和使用的环境内分泌干扰物,其暴露是肥胖等代谢综合征不可忽视的危险因素。许多研究显示,BPA暴露可促进高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的肥胖中脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophage,ATMs)的聚集及炎性细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β分泌,并干扰胰岛素信号通路加重肥胖衍生的IR,但在BPA促进肥胖衍生的IR中,免疫细胞分泌IL-1β的调控机制尚未阐明。NLRP3炎症小体是由胞内模式识别受体NOD(NOD-like receptors)样受体家族成员NLRP3形成的一个胞内蛋白复合物,可以被多种病原微生物和危险信号活化,调控IL-1β的分泌,从而参与多种人类重大疾病的发生过程。但BPA促进肥胖衍生的IR中,BPA对NLRP3炎症小体的激活并分泌IL-1β有何调控作用,以及促进HFD诱导的小鼠胰岛素抵抗的机制并不明确,有待进一步研究。研究目的在HFD诱导野生型(wild type,WT)肥胖小鼠模型的基础上,在不同时间检测不同剂量BPA暴露对HFD诱导小鼠IR表型、脂肪组织胰岛素敏感性、NLRP3炎症小体激活的影响,探讨BPA暴露促进HFD饮食小鼠IR中NLRP3炎症小体的激活情况。研究方法4周龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级C57BL/6JWT雄性小鼠60只,在一周适应性饲养后,随机分为正常饮食(normal chow diet,NCD)组、HFD组,HFD+10 nmol/L BPA组、HFD+100 nmol/L BPA组和HFD+1000 nmol/L BPA组,小鼠经饮水暴露不同剂量BPA。在饮水暴露8和16周时,分别称体重(body weight,BW)、进行葡萄糖耐量测试(glucose tolerance tests,GTT)和胰岛素耐受性测试(insulin tolerance tests,ITT);眼眦取血测空腹血糖(fasting glucose,FG)和空腹胰岛素(fasting insulin,FI),用稳态模型评估法(homeostasis model assessment,HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);ELISA检测小鼠血清中IL-1β、IL-10、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)的含量。处死小鼠,取附睾脂肪垫称重,组织病理学(histopathologic,HP)观察脂肪组织炎症及脂肪细胞大小,免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测脂肪组织中IL-1β及NLRP3的表达,免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测ATMs中NLRP3蛋白表达,q RT-PCR分析NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1βm RNA表达水平,Western Blot(western blot,WB)检测NLRP3、pro-caspase-1及其裂解产物caspase-1、pro-IL-1β及其裂解产物IL-1β蛋白表达,免疫印迹(immunoblot,IB)分析小鼠腹腔注射胰岛素(1m U/g BW)5min后,脂肪组织中IRS-1及p-IRS-1(Tyr612)、PI3Kp85及p-PI3K p85(Tyr458)、AKT及p-AKT(Ser473)的表达。结果1.BPA暴露对HFD喂养小鼠一般情况和体重的影响1.1一般情况小鼠在实验期间状态良好,未发生不良反应和死亡。同一时间点各组小鼠周平均饮水量和食物消耗量差别无统计学意义(P>0.05)。1.2 BPA暴露对HFD喂养小鼠体重的影响与NCD组相比,HFD组小鼠不同时间点平均体重均增加。与HFD组相比,BPA暴露组不同时间点小鼠平均体重呈剂量和时间依赖性增加。与NCD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA组从暴露第4周开始有差异(P<0.05),HFD+10 nmol/L BPA组和HFD+100 nmol/L BPA组从暴露第9周开始有差异(P<0.05),HFD组从暴露第10周开始有差异(P<0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA组从暴露第11周开始有差异(P<0.05)。HFD+1000 nmol/L BPA组在暴露第14周开始达到肥胖的程度。1.3 BPA暴露对HFD喂养小鼠附睾脂肪垫系数的影响与NCD组相比,HFD组小鼠的附睾脂肪垫系数增加。与HFD组相比,BPA暴露组不同时间点小鼠附睾脂肪垫系数呈剂量和时间依赖性增加。与NCD组相比,BPA暴露组小鼠在暴露8周和16周差异均有统计学意义(P<0.05)。HFD组小鼠仅在16周差异有显著性(P<0.05)。与HFD组相比,HFD+100 nmol/L BPA组和HFD+1000 nmol/L BPA组在16周差异有统计学意义(P<0.05)。2.BPA暴露对HFD喂养小鼠IR表型的影响2.1 BPA暴露对HFD喂养小鼠FG和FI的影响与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠FG和FI均升高。与HFD组相比,BPA暴露组小鼠FG在8周和16周差异均无统计学意义(P>0.05),HFD+1000nmol/L BPA组小鼠FI在8和16周差异有统计学意义(P<0.05)。相比NCD组,BPA暴露组小鼠HOME-IR在8和16周有显著性差异(P<0.05),相比HFD组,BPA暴露组小鼠HOME-IR在16周差异有统计学意义(P<0.05)。2.2 GTT和ITT小鼠在腹腔注射葡萄糖后,每一组的小鼠血糖水平都显著升高,在2 h后NCD组小鼠血糖浓度恢复正常值,HFD组和BPA暴露组小鼠血糖浓度仍高于正常值。与NCD组比较,BPA暴露组曲线下面积(area under the curve,AUC)显著升高,在16周差异有统计学意义(P<0.05)。与HFD组比较,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠AUC在16周差异有显著性(P<0.05)。小鼠在腹腔注射胰岛素后,每一组的小鼠血糖水平都显著降低,在2 h后NCD组小鼠血糖浓度恢复正常值,HFD组和BPA暴露组小鼠血糖浓度仍高于正常值。与NCD组比较,BPA暴露组小鼠胰岛素耐受曲线的AUC显著升高,在16周有差异(P<0.05)。与HFD组比较,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠AUC在16周差异有统计学意义(P<0.05)。3.BPA暴露对HFD喂养小鼠附睾脂肪组织胰岛素敏感性的影响小鼠脂肪组织中蛋白IRS-1、AKT、PI3K在暴露8周和16周时在各组之间的表达均无明显差异(P>0.05)。与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠脂肪组织中p-IRS-1、p-AKT、p-PI3K表达水平均下调,与HFD组相比,BPA暴露组小鼠蛋白表达水平呈剂量依赖性降低,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠脂肪组织中蛋白表达水平在8和16周的差异均有显著性(P<0.05)。4.BPA暴露对HFD喂养小鼠附睾脂肪组织中炎性细胞浸润的影响HE染色结果显示,与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠细胞明显变大,脂肪细胞间隙炎性细胞浸润增加,有剂量和时间依赖性。5.BPA暴露对HFD喂养小鼠血清中相关炎性因子表达水平的影响与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均随BPA暴露剂量的升高而增加,IL-10呈时间和剂量依赖性递减。与HFD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠血清中相关炎性因子表达水平在8和16周有统计学差异(P<0.05)。6.BPA暴露对HFD喂养小鼠附睾脂肪组织中炎性因子IL-1β和NLRP3的表达的影响6.1小鼠附睾脂肪组织免疫组化检测IL-1β和NLRP3表达结果免疫组化观察结果显示,与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠炎症因子IL-1β和炎症小体NLRP3的表达在脂肪组织中明显增加。分析平均累积光密度值(integral optical density,IOD)结果显示,与NCD组相比,BPA暴露组小鼠脂肪组织中IL-1β和NLRP3的IOD值在8周和16周增加明显(P<0.05)。与HFD组相比,BPA暴露组小鼠NLRP3的IOD值在8周和16周差异有统计学意义(P<0.05)。6.2 BPA暴露对小鼠ATMs中NLRP3蛋白表达的影响小鼠ATMs聚集的免疫荧光检测结果显示,与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠F4/80和NLRP3的表达明显增加,并呈剂量和时间依赖性。7.BPA暴露对HFD喂养小鼠附睾脂肪组织中相关m RNA表达水平的影响与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠脂肪组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βm RNA的表达水平均上调。与HFD组相比,BPA暴露组小鼠随BPA暴露剂量的升高而增加,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠脂肪组织中相关m RNA表达水平在8和16周的有差异(P<0.05)。8.BPA暴露对HFD喂养小鼠附睾脂肪组织中相关蛋白表达水平的影响与NCD组相比,HFD组和BPA暴露组小鼠脂肪组织中NLRP3、caspase-1、IL-1β表达水平上调,平均灰度值分析结果显示,与HFD组相比,BPA暴露组小鼠蛋白表达水平随BPA暴露剂量的升高而增加,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠蛋白表达水平在8和16周的差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白pro-caspase-1和pro-IL-1β在暴露8周和16周时在各组之间的表达均无明显差异(P>0.05)。结论1.BPA暴露改变HFD诱导的肥胖小鼠IR表型,并降低小鼠脂肪组织对胰岛素的敏感性。2.BPA暴露可促进HFD诱导的小鼠肥胖及脂肪组织炎症。3.BPA暴露促进HFD诱导的小鼠附睾脂肪组织NLRP3表达上调,且与IL-1β分泌增加相关。4.BPA在HFD诱导下长期暴露可激活NLRP3炎症小体,上调IL-1β的分泌,并通过对胰岛素信号通路的干扰加重肥胖衍生的IR。