研究背景学习记忆障碍是慢性肾衰中末期患者常见并发症,严重影响患者生活质量。目前关于慢性肾衰学习记忆障碍的发生机制尚未被阐明。近年来研究表明,促红细胞生成素（EPO）除促进造血之外,还有诸多其他作用,对学习记忆的影响是其中一种。但EPO是否与慢性肾衰病人的学习记忆障碍相关目前尚未见报道。右归饮是阴阳双调、补肾益精的经典方剂,有研究报道右归饮对慢性肾衰具有一定的改善作用,但其作用机制不清,右归饮对慢性肾衰学习记忆障碍是否具有改善作用及作用机制尚未见报道。研究目的1.研究EPO与慢性肾衰小鼠学习记忆障碍是否相关;2.研究EPO对小鼠海马区学习记忆重要通路Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1是否具有调控作用;3.研究右归饮对慢性肾衰小鼠学习记忆障碍是否具有改善作用,以及其作用机制是否与上调EPO及其海马区学习记忆重要通路Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1相关。方法与结果1.EPO与慢性肾衰小鼠学习记忆障碍的相关性研究方法:（1）采用腺嘌呤复制慢性肾衰小鼠模型,以肌酐清除率（Ccr）低于7μL·min^-1为慢性肾衰模型成功标准。（2）取模型成功的小鼠与正常对照小鼠进行新物体识别和Morris水迷宫试验,以试验指标显著低于正常小鼠判定慢性肾衰学习记忆损伤合格。（3）检测模型小鼠血清EPO含量及海马区EPO表达。（4）从造模第15天起,持续造模的同时给予模型小鼠腹腔注射rhEPO 5000 IU·kg^-1或相同体积的生理盐水,隔天1次共22天。给药结束后,检测rhEPO给药组小鼠的体质以及学习记忆改善情况。结果:（1）腺嘌呤所致慢性肾衰模型成功率100%。与正常对照组相比,模型组小鼠体重、体温显著降低,肾脏外观及组织形态出现明显病变,血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）显著升高,尿液CREA、BUN显著降低,Ccr显著降低,血清Ca、P、Mg显著升高（均p<0.05）。（2）腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠学习记忆能力显著下降。与正常对照组相比,模型组小鼠探索新物体的时间显著变短;在水迷宫中逃避潜伏期显著变长,穿越原平台次数显著减少,在原平台所在象限停留时间/总时间显著降低,在原平台所在象限游程/总游程显著降低（均p<0.05）,小鼠海马区组织形态出现明显病变。（3）腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠血清EPO与海马区EPO及其下游蛋白表达显著减少。与正常对照组相比,模型组小鼠血清EPO含量、海马区EPO及其下游蛋白EPOR、p-EPOR（Tyr485）、STAT5、p-STAT5（Tyr694）、AKT1、p-AKT1（Ser129）的表达均显著降低（均p<0.05）。（4）rhEPO对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠体质及其学习记忆障碍具有显著改善作用。与模型组小鼠相比,rhEPO组小鼠体重、体温显著升高,肾脏外观及组织形态均有不同程度的改善,血清CREA、BUN显著降低,尿液CREA、BUN显著升高,Ccr显著升高,血清Ca显著降低（均p<0.05）;并且探索新物体的时间显著变长,水迷宫中逃避潜伏期显著变短,穿越原平台次数显著增加,在原平台所在象限停留时间/总时间显著升高,在原平台所在象限游程/总游程显著升高（均p<0.05）,海马区组织形态明显改善。2.EPO对小鼠海马区学习记忆重要通路Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1的调控作用研究方法:（1）取复制成功的慢性肾衰小鼠以及rhEPO给药组小鼠,检测其海马区学习记忆第二信使Ca²⁺浓度以及学习记忆重要通路蛋白CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达水平。（2）构建条件性EPO基因敲除小鼠,检测其海马区CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达水平。（3）体外培养小鼠原代海马星形胶质细胞,分别检测EPO基因敲除以及rhEPO给药后细胞内Ca²⁺浓度以及CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达水平。结果:（1）rhEPO显著上调腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠海马区学习记忆重要通路Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1。与模型组小鼠相比,rhEPO组小鼠海马区细胞内Ca²⁺浓度显著升高,CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达显著上调（均p<0.05）。（2）EPO基因敲除小鼠海马区CaM/CaMKⅡα/CREB1通路蛋白表达显著降低。与野生型对照小鼠相比,EPO基因敲除小鼠海马区CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达水平显著降低（均p<0.05）。（3）EPO基因敲除星形胶质细胞Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1通路显著下调。与野生型对照组相比,EPO基因敲除组星形胶质细胞内Ca²⁺浓度显著降低,CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达显著减少（均p<0.05）。（4）rhEPO显著逆转EPO敲除星形胶质细胞Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1通路的下调。与EPO基因敲除组相比,EPO基因敲除+rhEPO组星形胶质细胞内Ca²⁺浓度显著升高,CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达水平显著升高（均p<0.05）。（5）rhEPO显著上调正常星形胶质细胞Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1通路。与空白对照组相比,rhEPO处理组星形胶质细胞内Ca²⁺浓度显著升高,CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达显著上调（均p<0.05）。3.右归饮对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠体质及学习记忆障碍的改善作用及其与EPO的相关性研究方法:（1）采用高效液相色谱法检测右归饮水煎液中已知9种有效成分的含量,采用液质联用色谱法检测右归饮水煎液中已知毒性成分及其衍生物含量。（2）采用腺嘌呤复制慢性肾衰小鼠模型,并于造模第15天时将造模小鼠随机分成模型组、右归饮5 g·kg^-1、10 g·kg^-1、20 g·kg^-1给药组,以体重、体温和Ccr确定组间无显著性差异后,持续造模的同时灌胃给予右归饮组小鼠相应剂量的右归饮水煎液并给予模型组相同体积的纯水,每天给药一次,共给药22天。另设一个正常对照组,每天饲喂普通饲料并给予相同体积的纯水。给药结束后,检测各组小鼠的体质,以Ccr低于7μL·min^-1为慢性肾衰模型成功标准。（3）取各组小鼠进行新物体识别和Morris水迷宫试验,以试验指标显著低于正常组小鼠判定慢性肾衰学习记忆损伤合格,并观察右归饮对慢性肾衰小鼠学习记忆障碍的改善作用。（4）检测各组小鼠血清EPO含量、海马区EPO及其上下游蛋白的表达。（5）检测各组小鼠海马区细胞内Ca²⁺浓度以及CaM、CaMKⅡα、p-CaMKⅡα（Thr286）、CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达。结果:（1）试验用右归饮水煎液主要成分含量测定结果。试验用右归饮水煎液中主要有效成分含量京尼平苷酸0.1046 mg·g^-1,莫诺苷0.3487 mg·g^-1,绿原酸0.1100 mg·g^-1,栀子苷0.0850 mg·g^-1,马钱苷0.1880 mg·g^-1,松脂醇二葡萄糖苷0.1630 mg·g^-1,甘草苷0.0610 mg·g^-1,芦丁0.1600 mg·g^-1,甘草酸0.0791 mg·g^-1;与毒副作用相关成分含量乌头碱7.5μg·g^-1,新乌头碱24.0μg·g^-1,次乌头碱70.5μg·g^-1,苯甲酰乌头原碱66.5μg·g^-1,苯甲酰新乌头原碱473.5μg·g^-1,苯甲酰次乌头原碱62.0μg·g^-1,符合药典规定。（2）右归饮对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠的体质具有显著的改善作用。与模型组小鼠相比,右归饮5 g·kg^-1、10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠的体重、体温显著升高,血清CREA、BUN显著降低,Ccr显著升高,血清P、Mg显著降低;右归饮20 g·kg^-1组小鼠尿液CREA显著升高;右归饮10g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠尿液BUN显著升高（均p<0.05）,肾脏外观及组织形态明显改善。（3）右归饮对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠学习记忆障碍具有显著的改善作用。与模型组小鼠相比,右归饮5 g·kg^-1、10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠探索新物体的时间显著变长,在水迷宫中于原平台所在象限停留时间/总时间显著升高;右归饮10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠在水迷宫中逃避潜伏期显著缩短,穿越原平台次数显著增多;右归饮20 g·kg^-1组小鼠在水迷宫中于原平台所在象限游程/总游程显著升高（均p<0.05）;右归饮5 g·kg^-1、10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠海马区组织形态明显改善。（4）右归饮改善腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠学习记忆障碍的作用与上调EPO密切相关。与模型组小鼠相比,右归饮10 g·kg^-1和20 g·kg^-1组小鼠血清EPO含量显著上升;海马区星形胶质细胞显著增多,HIF2α表达显著升高,EPO mRNA及蛋白水平显著升高,EPO下游蛋白EPOR、p-EPOR（Tyr485）、STAT5、p-STAT5（Tyr694）、p-AKT1（Ser129）的表达显著增多（均p<0.05）。（5）右归饮改善腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠学习记忆障碍的作用与上调受EPO调控的海马区Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1通路密切相关。与模型组小鼠相比,右归饮5g·kg^-1、10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠海马区细胞内Ca²⁺浓度显著升高;右归饮10g·kg^-1组小鼠海马区CaM表达显著上调;右归饮10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠海马区CaMKⅡα表达显著增多;右归饮20 g·kg^-1组小鼠海马区p-CaMKⅡα（Thr286）水平显著升高;右归饮5 g·kg^-1、10 g·kg^-1、20 g·kg^-1组小鼠海马区CREB1、p-CREB1（Ser133）的表达水平显著上调（均p<0.05）。研究结论1.腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠学习记忆障碍与海马区EPO的表达下调密切相关;2.EPO对海马区学习记忆重要信号通路Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1具有显著的调控作用;3.右归饮对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠体质及其学习记忆障碍均具有显著的改善作用;4.右归饮改善腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠体质及学习记忆障碍的作用机制与升高血中和脑内EPO含量,进而上调海马区学习记忆重要通路Ca²⁺/CaM/CaMKⅡα/CREB1密切相关。