Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)．是引起艾滋病全球性流行的主要病原体，HIV感染已成为威胁人类健康及社会发展的主要问题之一。P24壳体蛋白(capsid，CA)是HIV-1早期感染的一个重要标志<[1]>，Schwedler等证实，CA的N-末端与少至4个基质蛋白(Matfic，MA)的氨基酸残基结合就能形成球状颗粒结构，这种球状结构有利于病毒样颗粒(VLPs)结构和功能的形成。在动物及Ⅰ期临床实验中均已证实，HIV p24 VLPs疫苗能够刺激机体产生体液和细胞免疫。 植物表达系统属于真核细胞表达系统，不仅能进行正确的糖基化修饰、折叠、加工和组装等翻译后修饰加工，而且成本低廉，不需特殊的运输和储藏条件，因此被认为是一个比微生物或动物更理想的蛋白生产系统。“医药工厂农业化(medicine factory farming)”或“分子药田(molecular medicine farming)”的提出，引起了较为广泛的关注。转基因植物生产的亚单位疫苗具有良好的免疫原性，并且生产成本低廉，安全性高，便于运输和保存。 Borisjuk等建立了根分泌表达系统，该系统可以使转基因植物中表达的重组蛋白被引导进入根系，并不断地分泌到培养液中，简化了重组蛋白分离和纯化程序。较之其他表达系统(如植物细胞、植物器官培养)，根分泌表达系统更适合长期培养及规模化生产。 分泌蛋白为新药研制及工业化生产提供新途径。信号肽不仅能引导分泌蛋白出胞，还能引导蛋白质在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确定位。分泌性信号肽可以增加有效分泌机会，并且指引蛋白进入根系的分泌途径。分泌蛋白在内质网内进行糖基化修饰及二硫键形成，从而具有活性。 枸杞(Lycmm barbarum L)同烟草、马铃薯、西红柿一样，属于茄科植物。枸杞作为传统的中草药，其果实枸杞籽为著名的滋养药，有明目、降血糖、平血压的作用；根、嫩苗及叶可以清血、利尿、健胃。枸杞为常年生植物，其遗传性状更加稳定，且枸杞易于遗传操作。 本课题组将源于水稻的一个富含甘氨酸序列的信号肽(GRP)连接在MA4-CA融合基因的3端，并将该融合基因转入到枸杞中，建立转基因枸杞的根分泌表达系统，使转基因枸杞中表达的重组蛋白被引导进入根系，并不断地分泌到培养液中，这为今后大量生产高纯度重组蛋白奠定基础。转基因枸杞再生植株的建立，有利于其规模化的种植，枸杞籽易于贮藏和运输，HIV-1p24-VLPs疫苗不需要冷藏、疫苗生产成本低廉，对于发展中国家普及爱滋疫苗，具有重大的经济及社会价值。 研究目的： 利用本实验室构建的分泌型植物表达载体，通过根癌农杆菌对枸杞进行遗传转化，建立转基因枸杞的根分泌表达系统和再生植株表达系统，从基因水平及蛋白水平鉴定转基因枸杞，并对表达的MA4-CA融合蛋白进行初步定位。建立枸杞中HIV-1壳体蛋白的根分泌表达系统，为进一步研究植物HIV-1 CA-病毒样颗粒(VLPs)疫苗及今后大量生产高纯度重组蛋白奠定基础。 研究方法： 1)转基因枸杞根分泌表达系统及再生植株的建立：应用MS培养基为基本培养基，以各种不同激素配比进行枸杞愈伤诱导，分化诱导及根的诱导，离体毛状根系的固体和液体培养，并建立再生植株系统。 2)转基因枸杞表达重组HIV壳体蛋白的鉴定：提取枸杞植物基因组DNA，PCR扩增分析转基因植株内的目的基因。ELISA及Western blot实验鉴定转基因枸杞及其培养液中的HIV壳体蛋白的表达。 3)重组HIV壳体蛋白在转基因枸杞中的初步定位研究：应用免疫组织化学方法对转基因枸杞表达的CA融合蛋白进行初步定位，研究分泌蛋白的定位情况。 4)转基因烟草对照系统的建立及重组HIV壳体蛋白的鉴定：应用本实验室构建的携带植物表达载体pCAMBIA1305.2-MA<,4>-CA的根癌农杆菌EHA105以叶盘法转化烟草，将转有MA<,4>-CA融合基因的转化株诱导生根，并进行毛状根的培养：用PCR检测目的基因MA4-CA：以ELISA和Western blot鉴定MA<,4>-CA融合蛋白的表达情况。 研究结果： 1) 应用MS培养基为基本培养基，利用6-BA(6-苄基腺嘌呤)、NAA(a-萘乙酸)及IBA(吲哚丁酸)，成功地进行了枸杞再生芽诱导及根系诱导，通过毛状根系的固体及液体培养，建立了枸杞根分泌表达系统。成功的获得了枸杞再生植株。 2) PCR结果显示MA<,4>-CA融合基因成功导入枸杞中；ELISA和Western blot证实枸杞及培养液中的MA<,4>-CA融合蛋白以两种形式存在，分别为37 kDa和50 kDa，前者可能为糖基化形式的单体，后者为二聚体。 3) 采用免疫组织化学方法对转基因枸杞表达的CA融合蛋白进行初步定位，观察到在转基因枸杞愈伤组织中，CA主要在细胞浆、细胞壁和细胞间隙中表达，证实了利用GRP信号肽可以引导重组蛋白分泌表达。 4) 利用本实验室已构建的携带植物表达载体pCAMBIA1305.2-MA<,4>-CA的根癌农杆菌EHA105以叶盘法借助潮霉素筛选标记成功进行了烟草的遗传转化，PCR、ELISA和Western blot结果与转基因枸杞结果一致，为进一步研究HIV-1 CA-病毒样颗粒(VLPs)结构的生物学特性奠定基础。 结论： 利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化枸杞，成功地对转基因植株进行了分化及根系诱导，通过毛状根系的固体及液体培养，首次建立了枸杞根分泌表达系统，并构建了枸杞再生植株表达系统。PCR结果显示MA<,4>-CA融合基因成功导入枸杞中，ELISA和Western blot证实枸杞及培养液中的MA<,4>-CA融合蛋白以两种形式存在，分别为37 kDa和50 kDa，前者可能为糖基化形式的单体，后者为二聚体。免疫组织化学结果显示在转基因枸杞愈伤组织中，CA主要在细胞浆、细胞壁和细胞间隙中表达，证实了利用GRP信号肽可以引导重组蛋白分泌表达。实验结果表明成功构建了转基因枸杞根分泌及再生植株表达体系，为进一步研究植物HIV-1 CA-病毒样颗粒(VLPs)疫苗及今后大量生产高纯度重组蛋白奠定基础。