研究背景和目的:骨肉瘤是原发性骨肿瘤中最常见的,好发于儿童、青少年,恶性程度高,预后差。目前临床上治疗仍然以肿瘤切除联合多药物化疗为主,但化疗反应不良或转移患者5年生存率不到20%。因此,寻找有效的的分子靶点对骨肉瘤的治疗有非常重要的临床意义。ROCK2在肿瘤的发展和进程中起着重要的作用,参与调节细胞的收缩、粘附、迁移、增殖和凋亡。YAP1是Hippo信号通路的主要效应因子,对细胞增殖和凋亡都有关键的调节作用,与肿瘤的发生密切相关。近年来,大量研究都表明肿瘤的发生和进展与自噬密切相关。同时,有研究表明ROCK2和YAP1都可参与细胞自噬的调控,但在骨肉瘤中两者对自噬和肿瘤生长的作用和机制仍不清楚。本研究主要聚焦骨肉瘤中ROCK2和YAP1的表达及两者的相关性,并进一步探讨其对骨肉瘤自噬水平及生长的影响的具体机制。方法:1、qRT-PCR、Western blot检测各骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞中ROCK2水平,将构建好的shROCK2慢病毒感染ROCK2表达水平高的骨肉瘤细胞系,选出下调效果最好的shROCK2慢病毒细胞株,CCK8、Ed U和细胞集落形成实验检测细胞增殖能力的变化。再用流式细胞术来检测细胞周期和凋亡变化情况。最后,将构建好的骨肉瘤稳转细胞株shNC/U2-OS、shROCK2/U2-OS分别注射至裸鼠两侧的臀部皮下进行裸鼠成瘤实验,并观察裸鼠成瘤及瘤体大小生长情况。2、改变ROCK2的表达,观察骨肉瘤细胞自噬水平的变化。然后在ROCK2稳定下调的骨肉瘤细胞中加入自噬激动剂Rapamycin,在ROCK2稳定过表达的骨肉瘤细胞中加入自噬抑制剂3-MA,Western blot检测ROCK2、自噬和凋亡相关蛋白的表达情况,并用Ed U实验分析细胞增殖能力的改变。3、改变ROCK2的表达,观察骨肉瘤细胞YAP1表达变化情况。然后构建稳定转染m RFP-GFP-LC3慢病毒的骨肉瘤细胞株,在细胞株中抑制ROCK2表达的同时过表达YAP1及过表达ROCK2的同时下调YAP1的表达,Western blot检测YAP1、ROCK2和自噬相关蛋白的表达情况,用双荧光m RFP-GFP-LC3体系和透射电镜观察分析细胞自噬水平变化。最后用Co-IP验证ROCK2是否能直接与YAP1结合,进而调控其表达。4、qRT-PCR、Western blot及免疫组化实验分析骨肉瘤组织及其相对应癌旁组织中ROCK2、YAP1的表达,并分析骨肉瘤组织中两者表达的相关性。结果:1、下调骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63中ROCK2水平,CCK8、Ed U和细胞集落形成实验结果表明细胞生长能力减弱（p＜0.01）。流式细胞周期及凋亡实验发现细胞周期阻滞在G1期,细胞凋亡比例明显上升（p＜0.01）。裸鼠成瘤实验也同样证实降低ROCK2的表达后瘤体大小明显小于对照组（p＜0.001）。2、下调骨肉瘤细胞中ROCK2的表达,细胞自噬水平降低;反之,过表达ROCK2后细胞自噬水平升高。我们进一步研究发现在稳定低表达ROCK2的骨肉瘤细胞中加入自噬激动剂可以逆转ROCK2下调对细胞增殖能力的抑制作用,而自噬抑制剂则可以抑制ROCK2过表达所引起的细胞增殖能力增强（p＜0.01）。3、骨肉瘤细胞中抑制ROCK2表达,YAP1的表达水平也随之下降,而相反的过表达ROCK2后,细胞的YAP1表达水平也相应的升高。在稳定转染m RFP-GFP-LC3慢病毒的骨肉瘤细胞中下调ROCK2表达的同时过表达YAP1,Western blot、双荧光m RFP-GFP-LC3体系和透射电镜分析实验证明过表达YAP1能够恢复ROCK2下降所导致的自噬水平下降。相反,在稳定转染m RFP-GFP-LC3慢病毒的骨肉瘤细胞中过表达ROCK2的同时抑制YAP1,Western blot、双荧光m RFP-GFP-LC3体系分析和透射电镜分析实验结果表明YAP1的抑制能逆转ROCK2过表达所导致的自噬水平上升。最后用Co-IP实验验证ROCK2是否能直接与YAP1结合进而调控其表达,结果发现ROCK2与YAP1不能直接相互结合。4、qRT-PCR、Western blot实验显示骨肉瘤组织中ROCK2、YAP1的表达水平相较于相对应的癌旁组织显著升高（p＜0.001）。免疫组化结果显71.88%（23/32）的骨肉瘤组织标本中ROCK2高表达,而相对应的癌旁组织中仅有6.25%（2/32）高表达;81.25%（26/32）的骨肉瘤组织标本中YAP1高表达,而相对应的癌旁组织中仅有9.38%（3/32）高表达。进一步分析发现骨肉瘤组织中ROCK2、YAP1的表达水平呈正相关（p＜0.01）。结论:ROCK2通过介导YAP1的表达来调控骨肉瘤的自噬水平,从而促进骨肉瘤生长。我们的研究为骨肉瘤生长提供了新的理论基础和靶向治疗的理论研究方向。