论文部分内容阅读
背景和目的：研究证明，酒精性股骨头坏死时股骨头骨髓内脂肪细胞增殖肥大、骨细胞内脂质沉积，发生脂肪变性坏死。目前已知，PPARγ基因是一种成脂转录因子，在前脂肪细胞中不表达，而在脂肪分化过程中表达，并先于大多数脂肪基因的表达。酒精可直接诱导MSCs、NIH3T3成纤维细胞内PPARγmRNA的高表达，导致其大量分化成脂肪细胞，并抑制其向成骨细胞分化，是酒精性骨坏死的新的发病机理。表明MSCs向脂肪细胞分化过程中，PPARγ基因起着关键性调节作用，是发生酒精性骨坏死的一个重要靶基因。因此，我们采用RNAi技术，选用合适载体将干扰PPARγ基因表达的片段导入干细胞或体内或将转染干扰PPARγ基因表达的靶细胞植入酒精性股骨头坏死局部，使其在酒精性股骨头坏死部位持续干扰PPARγ基因的表达，从而预防和治疗酒精性股骨头坏死。我们构建两个PPARγ基因的shRNA逆转录病毒表达载体，为采用基因沉默技术从转录后水平进行骨坏死基因治疗的研究做准备。实验方法：1．目的片段的选择选择的目的片段，分别位于497-515，677-695密码子(GenBank Accession AF013266)利用网上http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html软件程序设计siRNA序列，然后用siRNA Hairpin Oligonucleotide Sequence Designer软件设计成双链发夹结构。双链的5’端引入BamHⅠ位点，3’端为ClaⅠ位点，2个酶切位点均呈粘性末端，中间19个核苷酸是用于形成发夹环结构，在靠近3’端有一个TTTTTT的U6启动子的终止信号。2．PPARγ基因的两个逆转录病毒载体pSINsi-hU6-PPARγ的构建合成的四条寡核苷酸片段分别退火成两条双链，两条退火双链分别与pGEM-T载体连接。用T7／SP6通用引物进行PCR扩增，小量提取质粒并测序；将带有BamHⅠ、ClaⅠ粘末端的497 DNA和677 DNA分别于双粘质粒pSINsi-hU6连接；选择阳性菌落用引物PPA1／PPA2行PCR扩增鉴定；BamHⅠ，HindⅢ和ClaⅠ，HindⅢ两次双酶切鉴定，确定插入片段大小。3．两个逆转录病毒载体对PPARγ基因表达的抑制作用将两个逆转录病毒载体转染EC9706细胞，按照转染试剂说明进行；48小时后，收集转染后的EC9706细胞，按常规Trizol法提取总RNA，将提取的总RNA逆转录后，在两个PCR扩增体系中进行PCR反应，该逆转录病毒载体对PPARγ基因表达有明显抑制作用。结果：1．pSINsi-hU6-PPARγ逆转录病毒表达载体经PCR扩增鉴定，所得片段大小约510bp。2．逆转录病毒表达载体pSINsi-hU6-PPARγ双酶切后，产生350bp，1100bp，5000bp和430bp，1100bp，5000bp十二条电泳条带。3．pGEM-497和pGEM-677克隆载体测序结果与已知序列比较完全一致。4．pSINsi-hU6-PPARγ转染EC9706细胞，48小时后，RT-PCR结果显示EC9706细胞内PPARγ基因无表达，转染克隆载体的EC9706细胞PPARγ基因的表达被充分抑制，达到实验目的。小结：1．本研究成功建立了PPARγcDNA克隆；2．成功构建了pSINsi-hU6-PPARγ逆转录病毒表达载体；