肝脏承担着机体物质代谢和生物转化的功能,血液供应丰富,因此肝脏易受到体内外的各种病原和刺激因子的侵袭,引起肝脏损害与炎症反应。肝脏长时期处于损伤状态,往往会导致肝纤维化的发生。肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝脏自我防护的损伤-修复反应,是一种渐进的病理过程。其疾病特征是以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内沉积,造成肝小叶结构改建、假小叶和结节形成,严重的肝纤维化可以发展为肝硬化,甚至肝癌。近年来研究发现,肝纤维化在去除了损伤因素后是可以逆转恢复的,表现为沉积的胶原降解,肝脏结构和肝脏功能的恢复。而肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖在肝纤维化形成过程中起关键作用因此,减少肝星状细胞的增殖成为阻止肝纤维化进程的途径之一。文献表明,在肝纤维化形成阶段瘦素(Leptin)及其受体(OB-Rb)的表达逐渐增加,可通过直接与星状细胞膜OB-Rb结合激活星状细胞,亦或与枯否细胞膜OB-Rb结合,激活枯否细胞促进转化生长因子β1(TGF-β1)等促纤维化细胞因子的分泌,进而促进肝星状细胞增殖,在肝纤维化形成过程中发挥了重要的作用。但是在肝纤维化逆转恢复期,瘦素及其受体的表达变化以及这种变化对肝星状细胞的增殖和细胞因子TGF-β1会产生的影响未见文献报道。为此,本研究选用四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化逆转恢复模型,观察肝纤维化逆转的不同时期瘦素及其受体的变化,探讨该变化与肝纤维化逆转的相关关系以及对可能的影响机制。研究内容主要包括以下两个部分:1、Leptin及TGF-β1与CCl4诱导大鼠肝纤维化模型逆转恢复的相关性研究CCl4是经典的肝纤维化诱导剂,可直接损伤肝细胞,通过炎症细胞集聚、释放细胞因子触发间质组织的过量产生,诱导大鼠形成肝纤维化;去除CCl4刺激后,肝脏炎症、肝细胞变性和坏死减轻,纤维化程度减轻,肝纤维化自然逆转恢复,这一过程可能与多种因素有关,但具体机制尚未明了。本研究采用SD大鼠背部皮下注射CCl412周,形成肝纤维化化,分别于停注后0周、2周、4周、6周、8周处死实验动物,动态观察肝组织病理和肝纤维化指标的变化,结果显示停注CCl4后大鼠肝组织病理逐渐减轻,肝指数、肝脏谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(CⅣ)和羟脯氨酸(Hyp)亦不断降低,至逆转恢复4周时,各项指标与正常组,比较无显著性差异,肝纤维化逆转恢复。研究结果与文献报道一致,证明本实验成功建立大鼠肝纤维化逆转恢复模型,为下一步研究奠定了基础。Leptin及TGF-β1在肝纤维化形成过程中具有重要的作用。Leptin是肝纤维化的始动因素之一,可与HSC、枯否细胞上表达的OB-Rb结合,经过细胞内信号通路,激活肝星状细胞和促肝维化细胞因子分泌,促进肝纤维化发展。TGF-β1对纤维化时形成的细胞外基质具有重要调控作用,与TGF-βRⅠ结合后激活HSC内Smad信号通路,促进HSC增殖,调节ECM合成与沉积。本研究观察到在肝纤维化自然逆转恢复过程中,血清及组织Leptin和TGF-β1在恢复0w时表达显著增高,经过2、4、6、8w恢复后逐渐降低,其下降趋势与肝纤维化血清及组织学指标HA、CⅣ、Hyp变化呈显著正相关(P<0.01),表明Leptin及TGF-β1下降对肝纤维化逆转恢复具有重要作用。进一步检测OB-Rb和TGF-βRⅠmRNA表达,结果显示在肝纤维化逆转恢复过程中,受体表达逐渐下调;同时检测核转录因子-κb(NF-κb)的蛋白表达变化,亦出现相同趋势。因此,Leptin及TGF-β1水平的下降,使OB-Rb和TGF-βRⅠ表达下调,影响了NF-κb激活,可能是影响肝纤维化逆转恢复的机制之一。2、JAK/STAT信号通路在肝纤维化逆转恢复期肝星状细胞的变化及瘦素对转化生长因子β1分泌的影响JAK-STAT通路是瘦素的主要信号转导途径,瘦素与其受体OB-Rb结合可引起JAK1、JAK2及受体胞质区磷酸化,并进一步使下游胞质蛋白STAT磷酸化,STAT磷酸化后转核内,调控相应基因的表达。文献表明,JAK-STAT通路的激活对HSC活化增殖以及各种促纤维化细胞因子的分泌具有重要调控作用。然而在肝纤维化逆转恢复期,该通路各蛋白的表达变化情况未见文献报道。本部分研究中,我们采用肝脏原位灌流、密度梯度离心的方法分离得到正常组、逆转恢复0周、逆转恢复4周组大鼠HSC,观察OB-Rb、JAK-STAT通路蛋白变化情况。同时选择瘦素对HSC的最佳刺激浓度,观察TGF-β1分泌。结果显示,肝纤维化逆转恢复4周组大鼠HSC上OB-Rb表达较低,JAK、STAT磷酸化程度较逆转恢复0周组显著降低。100ng·mL-1为瘦素最佳刺激浓度,作用于HSC后,TGF-β1蛋白分泌较正常对照组显著升高;Leptin+AG490(JAK蛋白特异性阻滞剂)作用HSC后仅检测到少量的TGF-β1,与正常对照组差异无统计学意义。可见JAK-STAT通路是Leptin调节TGF-β1分泌的重要途径。因此,在肝纤维化逆转恢复期,体内瘦素水平的降低,OB-Rb蛋白表达下调, JAK/STAT信号途径活化程度降低,使TGF-β1分泌减少,进而减轻对HSC的刺激,从而对肝纤维化的逆转恢复产生影响。