酵母核糖体组装因子Utp30的结构与功能研究

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核糖体由大小两个亚基组成,包含RNA和蛋白质组分,是所有生物中负责蛋白质翻译合成的重要细胞器,其加工成熟是一个高度复杂和受到精细调控的过程。真核生物酿酒酵母的核糖体发生起始于核仁中35S核糖体前体rRNA的转录,前体rRNA在众多组装因子的帮助下依次在核仁、核质和细胞质中完成修饰、剪切、折叠,伴随着核糖体蛋白的有序装配。  在核糖体发生的早期,伴随着35S rRNA在核仁中的转录,核糖体蛋白和组装因子开始结合,形成一个早期的核糖体前体,称为小亚基加工复合体(small subunit processome,SSU processome)或者90S核糖体前体(90S pre-ribosome),随着核糖体前体继续加工成熟,pre-rRNA A2位点切割后产生40S小亚基前体,并继续进行60S前体颗粒的组装,最终在细胞质中产生成熟的40S核糖体小亚基和60S核糖体大亚基,形成有功能的核糖体。  本工作研究的Utp30蛋白是90S核糖体前体组装因子,我们通过晶体学,遗传和生化的方法对Utp30的结构和功能进行了研究。我们首先通过蛋白质的表达纯化,结晶,使用硒代的方法从头解析了晶体相位,得到了分辨率为2.6(A)的Utp30蛋白质晶体结构,我们发现Utp30与其同源蛋白L1具有相似的结构。最新获得的90S核糖体前体复合物的电镜结构显示,Utp30与18S rRNA的helix41区域的上端有结合,通过同L1-RNA复合物的结构进行比较,我们发现Utp30和RNA的结合界面是保守的。  电镜结构中,Utp30和helix41结合区域附近还有一段长的α螺旋,不能确定其所属蛋白,我们推测该片段可能属于附近的Bms1蛋白。根据二级结构预测和凝胶迁移滞后实验结果,我们初步推测该α螺旋属于Bms1羧基端的1083-1183片段。进一步的研究发现Bms11083-1183片段在体外既能结合helix41对应的H41_56nt RNA也能非特异的结合其他RNA。接着我们通过酵母遗传学手段研究了Utp30和Bms11083-1183在功能上的相关性和重要性。结果发现单独的Utp30和Bms11083-1183对酵母的生长都不是必需的,但是Utp30和Bms11083-1183的同时缺失则会导致酵母严重的生长缺陷,这说明二者在遗传上具有合成致死的关联。同时,串联亲和纯化联合质谱分析的结果显示Utp30和Bms11083-1183的同时缺失会导致90S核糖体前体中一些蛋白组分含量的变化,提示Utp30和Bms11083-1183的同时缺失可能造成核糖体组装的缺陷。  综上,本论文的工作解析了Utp30的高分辨晶体结构,并发现了Utp30和Bms1之间的关联,为后续核糖体加工组装通路的相关结构和功能研究提供了新的线索。
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