松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松树的一种灾难性病害的病原生物，是引起松树萎蔫病的主要原因，但其致病机理目前说法不一，主要集中于毒素学说、空洞化学说和酶学学说等三种不同观点，并且大多数结论都是建立在疫木形态学变化的基础上，未能在分子水平上阐明其内在机理。近年来松材线虫纤维素酶的研究一直是松材线虫病病理学研究的一个热点，并取得了一定的进展。本研究为了在蛋白质水平和分子水平上阐明该病的部分致病机理，分别从不同角度对松材线虫纤维素酶进行了研究。 本研究首先通过形态学观察、同工酶分析、ITS-RFLP以及RAPD分析等方法分别对来自于不同国家和地区的40株线虫进行鉴定。结果表明，通过尾尖突的有无或形状的不同，可以初步区分松材线虫和拟松材线虫；利用谷草转氨酶的同工酶分析可以准确地区分上述两种线虫；基于分子生物学的ITS-RFLP分析除了可以准确地鉴定两种线虫外，还可以对拟松材线虫的地域特征作出判断，划分为亚洲型和欧洲型；而RAPD分析不仅能区分两种线虫，还可以描述各种松材线虫和拟松材线虫种内以及种间的遗传进化关系。借助RAPD分析结果，我们确定了具有代表性的安徽滁州马尾松(P.massiniana)(No.10)和美国木制包装中的松材线虫(No.12、No.13)以及四川邻水华山松(P.armandii)中的拟松材线虫(No.16)作为后续的研究的材料。 为了阐明松材线虫分泌的纤维素酶在松树疫木的病理学研究上的重要地位，本研究通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等方法对松材线虫纤维素酶进行初步纯化，得到了分子量分别为58.9kD和29.8kD的两种纤维素酶(BXC60和BXC30)。其中BXC60具有良好的抗原性，其水解羧甲基纤维素钠(CMC)的比活力为100.27U/mg，与纯化前的粗酶液的比活力相比提高了10.4倍，纤维素酶活力的回收率为23.9％。以纤维素酶BXC60为指标，利用抗松材线虫总蛋白抗体(Anti-BX)，本研究建立了一种选择性抗体酶联免疫分析法(SAEIA)，并显示了较好的特异性。利用该方法可以检测出疫木中存在的纤维素酶，其检测灵敏度为0.1μg/well，为松材线虫的研究提供一种简便、快捷地的手段。 以纯化的BXC60为抗原制备了高效价抗BXC60血清(Anti-BXC60)，同时提取免疫小鼠的脾细胞总RNA，通过抗体工程的方法，构建了库容量约为5×10<4>的单链抗体库。以BXC60为靶标进行筛选，获得scFv基因，并通过基因工程的手段，进一步将scFv与EGFP进行融合表达，获得了既具有绿色荧光的特性，同时具有与BXC60特异性反应功能的双功能融合蛋白。利用Anti-BXC60血清进行的免疫组化的结果表明，纤维素酶在线虫的食道腺处有很强信号反应，并且在吻部有微弱的信号，说明该酶可能产生于食道腺，并由口针向体外分泌。与此同时采用scFv-EGFP进行松材线虫活体染色的结果也显示，食道腺处可观测到明显的绿色荧光信号，与上述结论相吻合。进一步利用Anti-BX和Anti-BXC60两种抗血清，对松材线虫分泌物进行免疫学分析，结果显示，松材线虫可以通过分泌孔向体外分泌大量的可溶性蛋白；而纤维素酶的分泌则是通过口针向体外分泌。疫木切片的免疫组化染色结果显示，天然感染松材线虫的疫木样品中，含有大量的松材线虫蛋白抗原，其主要集中于纵向管胞细胞中，而致病性的纤维素酶抗原，则主要分布于管胞、树脂道和射线细胞中，表明松材线虫在感染松树的入侵初期，主要沿树脂道、射线及管胞细胞在树体内作横向或纵向的移动。 此外本研究采用3RACE和5RACE并结合RT-PCR的方法，分别获得三种不同来源的松材线虫纤维素酶基因BXC10、BXC12和BXC13。与报道的同本线虫的纤维素酶基因Bx-eng-3进行比对分析后发现，四种纤维素酶基因的同源性为95.83％。其中BXC10与BXC13的同源性为97.17％，基因大小相同，与聚类分析结果相一致；而BXC12的大小为1038bp，与Br-eng-3相比，分别少21或42个碱基的部分重复序列。分别将上述四个基因转入毕赤酵母进行表达，所表达的纤维素酶的活力相当，说明这种重复序列的缺失并不影响纤维素酶的活力。进一步经10L发酵罐发酵表达制备纤维素酶BXC10，发酵液比活力为7.70U/mg，并可以有效水解松木切片中的纤维素，平均每单位纤维素酶在24h内可以产生17±3.5ng还原糖。环境扫描电镜和X.射线小角散射的分析结果发现，切片表面随着时间的延长变得粗糙，纤维素结构变得稀疏，证明该酶能够破坏细胞壁，具有明显的致病能力，为松树萎蔫病的重要的致病因子之一。 综上所述，本研究从松材线虫的分离鉴定入手，选择代表性的线虫分离纯化其纤维素酶，并制备相应的纤维素酶抗体和scFv单链抗体，利用免疫组织化学方法，从蛋白水平上阐明了松材线虫纤维素酶的合成部位、分泌方式和侵染途径。进一步克隆了不同来源的纤维素酶基因，分析了基因序列与酶活的关系，并利用表达的纤维素酶进行致病能力分析，在分子水平上确认了松材线虫纤维素酶的致病性。