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目的:烧伤后血管通透性升高是引起低血容量性休克和多器官功能衰竭的重要原因,因此有效防治血管通透性的升高是烧伤治疗中的关键。由于血管通透性升高的机制还未阐明,目前尚未找到防治血管通透性升高和减少烧伤补液的有效措施,探寻血管通透性升高的机制及寻找一种新的降低血管通透性的药物显得非常重要。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)来源于细胞膜鞘磷脂的分解代谢,是血浆的一个重要组成成分,主要由血小板贮存分泌。目前已证明1-磷酸鞘氨醇是内源性血管内皮细胞屏障功能保护因子之一,但对烧伤后内皮屏障功能的影响未有报导。本研究拟应用显微外科技术、荧光比例技术、激光共聚焦显微镜成像技术和细胞免疫组化等方法,从整体、组织和细胞三个层次研究1-磷酸鞘氨醇对烧伤后高血管通透性的作用,为临床烧伤治疗提供新的思路。方法:1.烧伤模型的制备符合国家实验动物标准的SPF级BABL/c雄性小鼠30只,6～8周龄,18～22 g,背部剪毛约30%体表面积,8%硫化钠水溶液脱去残留毛,保鲜袋内装92℃水,袋外温度为90℃,假烧伤组保鲜袋内为37℃水,使其充分接触脱毛处9秒,至Ⅱ～Ⅲ烫伤,烫伤后立即通过肌肉注射给予每只小鼠生理盐水1ml(假烧伤组不予补液)。2.实验动物分组实验所用的主要S1P代谢制剂为两种:S1P和抑制S1P生成的N,N′-二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethylsphingosine,DMS)。整体、组织和细胞水平三个层次实验分组均如下:符合国家实验动物标准的SPF级BABL/c雄性小鼠30只,6～8周龄,18～22 g或SPF级Wistar雄性大鼠30只,三月龄,体重160～200 g,均由南方医科大学实验动物中心提供。动物随机分成6组,每组5只:①假烧伤组;②假烧伤+S1P组;③假烧伤+DMS组;④烧伤组:⑤S1P+烧伤组:⑥烧伤+S1P组。3.在体肠系膜微静脉通透性的观察剖腹寻找合适的肠系膜微静脉(直径10～50μm,血管周围无脂肪细胞包裹),正置荧光显微镜、实验室分析软件NIS-Element BR连续观察分析血管内荧光物质渗出情况。血管内的荧光密度值(Ii)和血管外渗出的荧光密度值(Io)分别由软件测定,血管通透性由Ii和Io的比率决定,表示为Pa,其Pa值越大表示通透性越高。观察时间为烧伤后20～50 min。4.游离微静脉的插管、灌流和通透性测定利用特制的玻璃套管对游离的单根皮肤微静脉两端插管,模拟体内循环状态进行血清和药物的灌注。用图像分析软件Imaging Workbench2计算一定时间内血管内外荧光强度,其比值的变化速率由通透系数Pa表示,Pa值越大表示通透性越高。5.激光扫描共聚焦显微镜观测肠系膜微静脉内皮细胞的F-actin免疫荧光染色。6.激光扫描共聚焦显微镜观测人脐静脉内皮细胞F-actin和VE-cadherin的双重免疫荧光染色。结果:1.整体水平(1)烧伤模型在补液后6 h的血压与假烧伤组没有显著差异。(2)增加假烧伤组小鼠体内的S1P浓度(假烧伤+S1P组)其Pa值与单纯假烧伤组在各时间点比较没有显著性差异,而给予DMS抑制S1P生成后(假烧伤+DMS组),与单纯假烧伤组比较血管外荧光物质渗出增加,Pa值在50 min时为0.82±0.07,显著高于假烧伤组0.66±0.12(P<0.05)。(3)烧伤后血管通透性明显升高,荧光显微镜下观察可见血管周边大量渗出的荧光物质,随时间延长明显增多。烧伤后25 min Pa值为0.74±0.07,50min Pa值为0.91±0.07,均显著高于假烧伤组(P<0.01)。(4)烧伤前30 min给予S1P(S1P+烧伤组),烧伤后25～50 min可见血管周围仅有少量荧光物质渗出,其Pa值在烧伤50分钟时为0.66±0.10,与单纯烧伤组比较显著降低(P<0.01);与假烧伤组没有显著性差异。烧伤后给予S1P(烧伤+S1P组),血管周围仍见大量荧光物质渗出,其Pa值与假烧伤组比较仍显著升高(P<0.05)。2.组织水平(1)正常血清灌流时游离微静脉的Pa值为0.85±0.53,给予S1P灌流30 min后Pa值与正常组比较无显著性差异,而给予DMS抑制S1P后Pa值升高,为2.84±0.19,与正常组比较显著升高(P<0.05)。烧伤血清灌流可引起单根游离微静脉通透性升高,Pa值为2.54±0.46,与正常组比较显著升高(P<0.05),预给予S1P灌流或后给予S1P治疗均可抑制烧伤血清诱导的高血管通透性,Pa值分别为0.73±0.26、0.76±0.19,与正常组没有显著性差异,而与烧伤组比较均有显著性差异(P<0.05)。(2)激光扫描共聚焦显微镜观测结果示:在假烧伤组肠系膜微静脉的内皮细胞骨架蛋白F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,界线清晰,整根血管显示出内皮细胞网络状结构;假烧伤后给予S1P同样可见整根血管显示纵形的内皮细胞形态;而给予DMS抑制S1P生成后血管内皮细胞形态不再完整,细胞骨架网络状结构离散;烧伤后血管内皮细胞形态变得模糊难辨;预防性先给予S1P可抑制烧伤后的内皮细胞形态学改变,可见完整的内皮细胞骨架,线条完整清晰,与假烧伤组形态一致;烧伤后再给予S1P治疗无法完全逆转烧伤诱导的内皮细胞F-actin形态改变,血管只显示残留断裂的F-actin。3.细胞水平(1)S1P对内皮细胞F-actin和VE-cadherin形态学影响的剂量效应:随S1P浓度增大(0.5μmol/L～1μmol/L),F-actin外周致密带变清晰,荧光强度增强,VE-cadherin具有与F-actin相似的变化;当S1P的浓度为10μmol/L时F-actin外周致密带变得粗糙不规则,VE-cadherin出现锯齿样断裂。(2)烧伤血清对内皮细胞F-actin和VE-cadherin形态学影响的时间效应:随着刺激时间延长,细胞内应力纤维明显增多,外周致密带越来越模糊,至6 h已无法辨清细胞形态;VE-cadherin由细胞周边向胞浆弥散越来越明显,至6 h细胞周边的VE-cadherin网络结构消失,出现分布内化现象。(3) S1P对烧伤血清引起内皮细胞F-actin和VE-cadherin形态学改变的作用:正常内皮细胞中F-actin和VE-cadherin二者重叠分布于细胞周边,形成外周致密带;S1P刺激后二者外周致密带变得更加光滑,线条清晰连续;而给予DMS刺激后F-actin外周致密带发生断裂,细胞骨架难辨,VE-cadherin发生类似变化;烧伤血清刺激后内皮细胞可见大量应力纤维形成,VE-cadherin发生断裂;预防性给予S1P可抑制此改变,与正常内皮细胞分布类似;先用烧伤血清刺激再给予S1P可逆转内皮细胞F-actin和VE-cadherin的形态改变,与正常内皮细胞分布类似。结论:1.在整体水平,S1P对正常血管通透性起保护作用;烧伤可导致血管通透性升高;S1P在整体水平上可预防烧伤后血管通透性的升高。2.在组织水平,S1P可维持微静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin的正常形态;烧伤导致微静脉内皮细胞F-actin外周致密带断裂,引起血管通透性升高;S1P可预防和逆转烧伤后单根游离微静脉通透性的升高。3.在细胞水平,1-磷酸鞘氨醇促使内皮细胞骨架蛋白F-actin和粘附连接蛋白VE-cadherin在细胞周边的分布,在一定浓度范围内成剂量效应(0.5μmol/L～μmol/L),而浓度为10μmol/L时则导致应力纤维形成和VE-cadherin内化;烧伤血清诱导内皮细胞F-actin重排和粘附连接蛋白VE-cadherin内化,在30 min～6 h呈时间效应;1-磷酸鞘氨醇可预防和逆转烧伤诱导的内皮细胞F-actin和VE-cadherin的重排和内化。