研究背景肥胖已成为全球性的、严重的社会公共卫生问题。据世界卫生组织统计,全球目前至少有10亿成年人超重,3亿人肥胖。肥胖是导致高血压、冠心病及糖尿病等多种慢性病的独立危险因素。近年的研究表明,内皮功能障碍是动脉粥样硬化、高血压等血管病变的早期表现,处于心血管事件链的始动环节;而内皮胰岛素敏感性对内皮和血管功能的维持具有重要作用。动物实验及临床研究均显示,血管内皮胰岛素抵抗可导致内皮功能障碍,而改善内皮胰岛素敏感性可提高内皮功能、减轻心血管损伤。然而,肥胖是否引起内皮胰岛素抵抗及内皮功能障碍,引起内皮胰岛素抵抗的原因是什么?目前仍不清楚。生理情况下,线粒体活性氧族(mitochondrial ROS,mt ROS)参与血管稳态维持及血管功能调节,然而在病理情况下,过量的mt ROS产生会激活血管内皮细胞损伤信号并导致内皮功能障碍。沉默调节蛋白3(sirtuin 3,SIRT3)是线粒体中NAD+依赖的一种去乙酰化酶,主要维持线粒体代谢和氧化还原平衡。研究显示,代谢综合征、衰老及肺动脉高压等疾病均与SIRT3下调有关。然而,SIRT3在内皮稳态与血管功能维持中的作用和意义目前尚不清楚。我们初步研究发现,肥胖小鼠和肥胖患者的血管中SIRT3表达下降,这提示我们SIRT3可能参与了肥胖引起的内皮功能障碍,本研究旨在进一步明确SIRT3在内皮稳态与血管胰岛素敏感性维持中的作用。实验目的1.明确SIRT3是否参与肥胖引起的血管内皮胰岛素抵抗;2.如果是,研究肥胖诱导血管内皮胰岛素抵抗和血管功能障碍的具体机制,尤其是SIRT3和mt ROS在其中的作用。实验方法1.我们与西京消化病医院合作,选择了12例拟行减肥手术的肥胖病人(BMI≥30kg/m2,HOMA-IR≥3.8)和8例拟行其他腹部手术(胆囊切除、食管裂孔疝修复或食道失弛缓症手术)的正常体重者(BMI<30 kg/m2,HOMA-IR<3.8)。肥胖组排除标准为已有心血管病史或具有心血管疾病的临床表现包括充血性心衰、冠心病、高血压,但不包括2型糖尿病和高脂血症。对照组排除标准为糖尿病、高血压、心血管病史或具有心血管疾病的临床表现以及其他可能干扰研究的情况。在征得病人同意后术中取病人少量肠系膜组织,实验室分离肠系膜动脉并制备血管环,采用DMT 610M多通道成像系统检测血管舒张功能,采用蛋白免疫印迹技术检测SIRT3蛋白表达。2.为探讨肥胖、血管胰岛素敏感性及SIRT3表达的关系,我们采用8周龄的雄性129Sv小鼠,高脂饮食饲养24 wk建立肥胖小鼠模型。处死动物前,进行腹腔内注射葡萄糖耐受实验(IPGTT)和腹腔内注射胰岛素耐量实验(IPITT),分离小鼠主动脉检测血管舒张功能。首先用苯肾上腺素(PE,10-5 M)预收缩主动脉血管环,并分别加入乙酰胆碱(ACh,10-10-10-5 M)、胰岛素(10-9-10-6 M)和硝普钠(SNP,10-10-10-5 M),记录血管张力变化。血管舒张结果表示为舒张张力与预收缩张力的百分比。3.为明确SIRT3在内皮细胞胰岛素抵抗模型中表达的变化,我们给予内皮细胞500μM棕榈酸盐处理24 h建立高脂诱导的细胞胰岛素抵抗模型,检测基础状态和胰岛素刺激状态下内皮细胞Akt、p-Akt(Ser473)、e NOS、p-NOS(Ser1177)及SIRT3蛋白表达;采用DAF2 DA探针检测细胞一氧化氮(NO)水平,并用Nikon Eclipse Ti-E倒置显微镜采集图像。利用Griess试剂法检测细胞培养上清总NO水平。4.为了进一步明确SIRT3与内皮胰岛素抵抗的关系,我们利用SIRT3 si RNA或Scramble si RNA转染内皮细胞,观察下调SIRT3对内皮细胞胰岛素敏感性及NO水平的影响。采用Mito SOX探针检测线粒体O2?-水平,用共聚焦显微镜观察并采集图像。采用SIRT3慢病毒(Lv-SIRT3)或阴性对照慢病毒(Lv-p CMV)感染内皮细胞,观察过表达SIRT3蛋白对棕榈酸盐诱导的内皮细胞胰岛素抵抗及NO水平的影响。5.采用蛋白免疫印迹方法检测SIRT3蛋白表达水平或锰超氧化物歧化酶(SOD2)和乙酰化SOD2(Lys68)水平(以β-actin作为内参);采用实时定量PCR技术检测SIRT3 m RNA水平(以18S r RNA作为内参)。6.数据采用Graph Pad Prism version 5.0程序进行统计学分析,两组数据间比较采用t检验;两组以上数据间比较采用方差分析(ANOVA)或重复测量方差分析。Western blot灰度值分析采用Kruskal-Wallis检验。实验结果表示为平均数±标准误,P<0.05为差异有显著性。实验结果1.与对照组相比,肥胖病人肠系膜动脉血管SIRT3蛋白表达降低约40%(P<0.01);血管对胰岛素的舒张反应下降约30%(P<0.05);2.与正常饮食组相比,给予小鼠高脂饮食24 wk,体重显著增加(P<0.05),而血管SIRT3蛋白表达下降为正常饮食组的1/4(P<0.01)。此外,24周龄的ob/ob肥胖小鼠血管SIRT3蛋白表达也显著下调(P<0.05)。与正常饮食的小鼠相比,高脂诱导的肥胖小鼠对胰岛素诱导的血管舒张反应明显下降(P<0.01),而两组血管对SNP诱导的舒张反应无显著差别,表明肥胖小鼠出现内皮胰岛素抵抗。3.与对照组相比,棕榈酸盐处理24 h可导致血管内皮细胞胰岛素抵抗,表现为胰岛素诱导的Akt Ser 473和e NOS Ser 1177磷酸化下降以及NO释放减少;基础状态下内皮细胞Akt和e NOS的蛋白表达及磷酸化水平无显著差别。与对照组相比,棕榈酸盐处理内皮细胞4 h和8 h时SIRT3蛋白表达有所下降但并不显著,然而,在给予棕榈酸盐处理16 h和24 h后,SIRT3蛋白表达分别降低约25%和50%,(P<0.01)。4.转染SIRT3 si RNA导致内皮细胞SIRT3蛋白表达下降80%,并显著抑制胰岛素诱导的Akt和e NOS磷酸化及NO释放,提示内皮细胞对胰岛素的敏感性降低。与阴性对照慢病毒(Lv-p CMV)相比,SIRT3慢病毒(Lv-SIRT3)感染显著提高了SIRT3蛋白表达,改善了棕榈酸盐诱导的内皮胰岛素抵抗,表现为胰岛素诱导的Akt及e NOS磷酸化升高,NO释放增加(P<0.05)。5.IPGTT和IPITT结果显示,SIRT3缺失明显加重了高脂饮食引起的葡萄糖耐量和胰岛素耐量受损。在正常饮食条件下,SIRT3敲除小鼠和野生型小鼠对胰岛素或ACh诱导的血管舒张反应无显著差别。但与高脂饮食的野生型小鼠相比,高脂饮食的SIRT3敲除小鼠血管对胰岛素诱导的舒张反应显著降低(P<0.05),对ACh诱导的舒张反应也显著降低(P<0.01)。各组血管对SNP引起的舒张反应无显著差别,表明SIRT3缺失可加速内皮胰岛素抵抗,而对平滑肌的舒张功能无影响。6.与高脂饮食的野生型小鼠相比,高脂饮食的SIRT3敲除小鼠血管mt ROS水平显著升高。棕榈酸盐处理或转染SIRT3 si RNA均可显著增加内皮细胞mt ROS水平,而SIRT3慢病毒感染可抑制棕榈酸盐诱导的mt ROS过量产生。转染SIRT3 si RNA显著抑制了内皮细胞胰岛素刺激的NO产生,而给予mt ROS清除剂Mito TEMPO可促进内皮细胞胰岛素诱导的NO释放。利用Mito TEMPO清除mt ROS可显著改善高脂饮食SIRT3敲除小鼠血管对胰岛素的最大舒张反应(P<0.01)。与正常饮食组相比,野生型小鼠高脂饮食24 wk后,血管中SOD2蛋白表达水平没有变化,然而其乙酰化水平显著增加(P<0.01)。结论本课题研究发现,肥胖小鼠和肥胖患者的血管中SIRT3表达下降;SIRT3缺失可促进血管内皮mt ROS过量生成和胰岛素抵抗,导致血管功能障碍;而过表达SIRT3可改善高脂诱导的内皮胰岛素抵抗。上述结果提示,血管内皮细胞SIRT3是正向调节内皮胰岛素敏感性中的一个关键分子,并可能是防治肥胖相关血管疾病的一个潜在靶点。