【摘 要】
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目的: 利用pET-22b(+)载体表达、纯化及鉴定AmpR融合蛋白,为研究质粒AmpC酶表达调控功能提供研究基础。 方法: 以我院临床分离产DHA-1型质粒AmpC酶的4株大肠埃希菌和10株
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目的: 利用pET-22b(+)载体表达、纯化及鉴定AmpR融合蛋白,为研究质粒AmpC酶表达调控功能提供研究基础。
方法: 以我院临床分离产DHA-1型质粒AmpC酶的4株大肠埃希菌和10株肺炎克雷伯菌为研究对象,采用聚合酶链反应(PCR),用特异性引物扩增AmpR调节因子全编码基因,并将一株肺炎克雷伯菌AmpR基因克隆到pET-22b(+)载体质粒中测序。序列正确后转化到表达菌E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经变性、纯化、复性后进行Western-blot鉴定。
结果: PCR扩增出约876bpDNA片段,序列测定证实与摩根摩根菌染色体上AmpR基因同源性达98％。重组质粒pET-22b/AmpR转化E.coli BL21(DE3)后表达融合蛋白的相对分子量为34KD,与预期分子量相符,能与His单抗产生结合反应,Western-blot显示特异的单一条带。
结论: 成功构建pET22b(+)-AmpR重组表达质粒,表达并纯化出高纯度的6×His AmpR融合蛋白,为研究质粒AmpC酶的诱导性耐药机制奠定了基础。
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