生物学中的一个仍然未解决的基本问题就是:蛋白质内部不同层次的相互作用是如何决定蛋白质结构的稳定性和折叠过程。回答这个问题需要我们用不同的实验技术在不同的层次上详细地研究蛋白质折叠过程和可能存在的平衡中间态的构象和动力学情况。一些模式蛋白质的折叠过程属于两态折叠平衡,其不同结构单元只表现为一个协同变化过程。然而另外一些蛋白却有更加复杂的折叠平衡过程,在折叠过程中有稳定的中间态出现。其中平衡中间态被广泛的认为就是体外蛋白质折叠过程中应有的动力学（Kinetics）中间态,或者是体内的非天然构象产物。近些年来关于平衡中间态的构象和动力学研究已取得了重要的进展。本论文工作的重点包括如下两个部分:（1）用NMR spectroscopy（核磁共振波谱）,DSC（差示扫描量热）,CD spectroscopy（圆二色光谱）,Fluorescencespectroscopy（稳态荧光光谱）以及Stopped-Flow（快速混合停流）这五种实验方法在不同的角度详细地研究了Box-5蛋白质的可逆三态去折叠过程。我们第一次发现了Box-5蛋白质在55℃时存在一个热力学折叠中间态系综,并用如上方法对这个中间态的构象和主链动力学做了透彻的分析。我们的实验结果暗示了一个Box-5蛋白质的helix-turn-helix（HTH）柔性折叠模型。具体的讲就是在Box-5蛋白质的折叠过程中,先由螺旋1和螺旋2在中间态中形成helix 1-turn-helix 2范式,然后两个疏水折叠核心形成并进一步促成了螺旋3的形成。这个helix-turn-helix（HTH）柔性折叠模型是第一次在HMG Box蛋白质家族中被发现。（2）人源Sox-4蛋白质的HMG结构域的基因克隆,表达纯化,NMR溶液结构以及其与14bp双链DNA特异性相互作用的研究。第一章是对离体条件下蛋白质稳定性和折叠研究的一个综述。简要的介绍了蛋白质的稳定性理论以及蛋白质折叠的传统理论模型。着重介绍了近些年国际上关于蛋白质折叠的各种状态及蛋白质折叠机理研究的新观点.最后我们介绍了近几年研究蛋白质稳定性,折叠和功能关系的几个实例。但是没有包括蛋白质折叠的重要方面:细胞内蛋白质折叠。第二章是关于蛋白质稳定性和折叠研究方法的一个综述。我们介绍了本论文工作所涉及的量热法（DSC）,生物光谱学方法,快速停流（Stopped-Flow）方法以及液体核磁共振波谱（NMR）方法。其中对NMR方法研究平衡条件下蛋白质非天然态的构象和动力学内容做了详细的介绍。如,各种NMR参数（CSI,NOE,PRE,RDC等）的介绍,以及谱密度函数作图分析方法（Spectral density mapping）研究非天然态蛋白质的主链动力学特征等。第三章是本论文的主要研究工作:Box-5蛋白质稳定性和折叠的研究内容及其实验结果讨论。DSC实验表明Box-5蛋白质从5℃到95℃的量热扫描过程是可逆的两个转变过程。其中第一个转变过程（N←→I）包括了30%的全部去折叠焓变,第二个转变（I←→U）过程包括了其余的70%的全部焓变。生物光谱学实验表明Box-5蛋白质的不同结构单元在热转变过程中表现并不同步/协同,而且在55℃附近存在部分去折叠的热力学中间态。这个中间态系综包含有约82%的天然态二级结构和大约65%的三级结构,然而其主要疏水核心已经暴露。不同实验方法拟合得到的三态折叠热力学参数都比较一致。核磁共振化学位移分析和相邻残基¹HN_i-¹HN_i+1 NOE分析表明螺旋1和螺旋2拥有天然态类似的二级结构,螺旋3发生了部分去折叠。详细的核磁共振主链驰豫动力学数据表明,在天然状态下,Box-5蛋白质的整体运动相关时间（约9.5ns）和内部运动相关时间（约1.1ns）有较大差异;相比较而言,在Box-5热力学中间态系综下,主链的动力学随氨基酸残基分布比较均匀,其拥有更快的整体运动相关时间（约4.7ns）和相似的内部运动相关时间（约1.3ns）。NMR驰豫动力学数据计算的主链构象熵变数据说明W14,W41,W52和Y63有最大的构象熵增加,表明这些氨基酸残基对天然态构象稳定性起主要贡献.而V18,K27,A56,以及C-端从M70到E84的氨基酸残基有负的熵变,说明了这些氨基酸残基在中间态中运动更加受限,其暗示这些氨基酸残基可能参与了中间态系综的非天然相互作用.此外,GdnHCl稀释的Stopped-Flow实验也检测到了Box-5蛋白质的折叠动力学（Kinetics）中间态的存在.我们的实验结果暗示了一个Box-5蛋白质的helix-turn-helix柔性折叠模型。具体的讲就是在Box-5蛋白质的折叠过程中,先由螺旋1和螺旋2在中间态中形成了helix 1-turn-helix 2范式,然后两个疏水折叠核心形成并进一步促成了螺旋3的形成。当然,这一折叠模型还有待近一步实验证明。第四章的工作是关于人源Sox-4蛋白质HMG结构域的基因克隆,表达纯化,NMR溶液结构以及其与14bp双链DNA特异性相互作用的研究。Sox基因的全称是睾丸决定因子基因相关box基因（SRY（Sex-determining Region,Y chromosome）-related box）.Sox基因在早期胚胎发育过程中参与多种发育途径,具有重要的功能.参与诸如性别决定、骨组织的发育、血细胞生成过程、神经系统的发育、晶状体的发育等多种早期胚胎发育过程.Sox基因中的HMG结构域长度约为79个氨基酸残基,可以以序列特异性的方式与DNA的小沟结合,使其产生较大的弯曲,从而调节靶基因的表达。我们的凝胶迁移率变动实验证明了人源Sox-4 HMG蛋白质特异性的识别5’-AACAAAG-3’双链DNA序列.ITC实验测定出Sox-4 HMG蛋白质与14bp双链DNA的结合过程是熵驱动的,其解离常数是1.30^*10^-6 M,属于中等强度的结合过程。NMR化学位移扰动实验推测出Sox-4 HMG蛋白质的一个侧面上的一些带电荷氨基酸,如H27,R38,H61和R56,构成了其与DNA相互作用的潜在位点.NMR主链驰豫动力学实验分析显示Sox-4 HMG蛋白质的Helix 1和Helix 2区域的氨基酸残基在DNA结合后运动明显变慢.DNA结合过程引起的Sox-4 HMG蛋白质主链构象熵减小数值只占DNA结合过程总熵变的十四分之一。所以,ITC实验得到的结合过程熵驱动的结论可能主要是由于DNA结合过程中Sox-4 HMG蛋白质的溶剂可接近表面变化以及侧链的构象熵变化引起。