多发性内分泌腺瘤病2A型(MEN2A)是多发性内分泌腺瘤病(Multiple endocrine neoplasia MEN)的一种亚型，为一种常染色体显性遗传性肿瘤综合征，发病率约1/3万。MEN可分为MEN1和MEN2。MEN2A，又称为Sipple综合征，占MEN2的60％，主要表现为甲状腺髓样癌(MTC)、嗜铬细胞瘤(PHEO)和甲状旁腺功能亢进症(HPT)。几乎所有的MEN2A患者出现甲状腺髓样癌，50％出现嗜铬细胞瘤，15％～30％出现甲状旁腺功能亢进症(增生或腺痛)；MEN2B主要表现为甲状腺髓样癌、黏膜神经纤维瘤和嗜铬细胞瘤；此外，MEN2还有几种特殊类型，包括家族性甲状腺髓样癌(FMTC)、MEN2A合并皮肤苔藓样淀粉样变、MEN2A或FMTC合并先天性巨结肠。自1993年Donis-Keller等发现RET原癌基因突变引致MEN2A后，目前全世界报道的所有MEN2家系均为RET原癌基因突变所致，进一步研究发现RET原癌基因突变类型与MEN2的临床表现形式相关。本研究对两个明确为MEN2A家系中的患病成员及大部分其他家庭成员进行相关基因检测，以期明确这两个家系RET原癌基因的突变方式，并对两个家系的相关临床表现进行比较。为开展单基因突变疾病的诊断提供思路。 研究目的: 探讨两个多发性内分泌腺瘤病2A型(MEN2A)家系的RET原癌基因突变方式和相关临床特征。通过对两个MEN2A家系的分析，为开展单基因突变疾病的诊断提供思路。 研究方法: 一．研究对象 1.家系1 1.1先证者(Ⅱ：13)：男，37岁，经手术病理检查诊断为双侧肾上腺嗜铬细胞瘤。术后1个月患者被诊断甲状腺髓样癌，手术后病理提示甲状腺髓样癌。分别于术后5个月和1年两次复查甲状旁腺B超正常，血清钙磷、血降钙素(CT)、血甲状旁腺激素(iPTH)、血甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)水平均正常，癌胚抗原(CEA)阴性。 1.2先证者姐姐(Ⅱ：12)： 女，40岁，经手术病理证实为双侧肾上腺嗜铬细胞瘤。术后1年复查甲状腺、甲状旁腺B超正常，血清钙磷、MN和NMN水平正常，CEA阴性；但血CT及iPTH水平升高。 1.3先证者弟弟(Ⅱ：15)： 男，35岁，外院诊断为甲状腺髓样癌，行手术切除(具体术式不详)，病理证实为甲状腺髓样癌。术后行双侧肾上腺CT发现右侧肾上腺腺瘤，左侧肾上腺结节样增生，未予治疗。术后9个月查血清钙磷、MN、NMN及血CT在正常范围，但血iPTH水平升高。 1.4家系1中其他家庭成员情况： 先证者弟弟(Ⅱ：17)，男，33岁，甲状腺B超发现左侧甲状腺上极内有一占位病变，于外院行手术切除治疗(具体术式不详)，病理为结节性甲状腺肿。术前、术后血清降钙素水平均正常，术后随访中血清钙磷、CT、血MN、NMN水平均正常，iPTH水平升高，CEA阴性，甲状旁腺及肾上腺B超未见异常。 对Ⅱ：3(男，50岁)、Ⅱ：4(女，50岁)、Ⅱ：7(男，45岁)、Ⅱ：9(男，43岁)、Ⅱ：10(女，43岁)、Ⅱ：16(女，34岁)、Ⅲ：4(男，18岁)、Ⅲ：7(男，19岁)、Ⅲ：9(男，13岁)、Ⅲ：10(男，12岁)、Ⅲ：11(男，10岁)、Ⅲ：12(男，6岁)、Ⅲ：13(男，6岁)家庭成员进行的血清钙磷、CT、血MN、NMN等水平检查均正常，而在iPTH的检测中，发现3位家庭成员iPTH水平升高：Ⅱ：10、Ⅲ：9、Ⅲ：13；其中对Ⅲ：4、Ⅲ：11、Ⅲ：13进行甲状腺、甲状旁腺和肾上腺B超检查，均未发现异常。 2.家系2 2.1先证者(Ⅱ：5)，男，27岁，手术并病理证实诊断为双侧肾上腺嗜铬细胞瘤。术后3年复查血清钙磷、iPTH、NMN、MN水平无明显异常，CEA阴性，血CT明显升高，B超提示甲状腺双侧叶内实质性占位病变，可见钙化，尚未行手术治疗。甲状旁腺B超未见异常。 2.2先证者兄长(Ⅱ：3)，男，36岁，经手术病理诊断为双侧肾上腺嗜铬细胞瘤。血清钙磷、血iPTH水平正常，CEA阴性，血CT水平升高。B超发现甲状腺多发结节，未见钙化，尚未行手术治疗。甲状旁腺B超未见异常。 2.3家系2中其他家庭成员情况： Ⅲ：3，先证者的侄子，男，8岁，病史及查体无特殊。血钙正常，血磷偏高，血CT、iPTH、 MN、NMN、血游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)水平均正常，血CEA阴性；甲状腺B超见两侧叶多发囊性病变；甲状旁腺和肾上腺B超未见异常。 Ⅲ：4，先证者的儿子，男，1岁，病史及查体无特殊。血钙磷、iPTH、MN、NMN水平均正常，CEA阴性，血CT水平升高；甲状腺、甲状旁腺及肾上腺B超未见异常。 二．实验方法： 1.PCR扩增：用盐析法提取研究对象的外周血淋巴细胞基因组DNA。对两个家系的先证者PCR扩增出RET原癌基因中发生突变率较高的第8、10、11、13、14、15和16这7个外显子的基因片段进行测序(相关引物均由上海瑞金医院内分泌研究所馈赠)(见表1)，PCR反应体系为20μL(见表3)。再根据先证者发生突变的位点，对其家庭成员进行相应外显子测序。为排除合并其他位点的基因突变，对家系1中的先证者DNA的其余的14个外显子(第1、2、3、4、5、6、7、9、12、17、18、19、20、21)也进行了扩增测序。 2.DNA测序分析：PCR产物根据Sanger双脱氧链终止法原理，用PE公司ABIPRISMTM377荧光自动测序仪测序。 3.亚克隆测序：家系1中的先证者及其姐姐的PCR产物经测序后发现第11外显子存在新的突变方式，为了进一步明确突变位点进行亚克隆测序。 4.生化指标测定：相关血生化指标由本院内分泌科实验室及生化实验室进行检测。 结果: 1.在家系1的先证者(临床诊断为MEN2A，双侧肾上腺嗜铬细胞瘤和甲状腺髓样癌)，其一姐(临床诊断为MEN2A，双侧肾上腺嗜铬细胞瘤)，其一弟(临床诊断为MEN2A，甲状腺髓样癌)及另外2例未发病的家庭成员(Ⅱ：17、Ⅲ：10)中，发现了RET原癌基因第11外显子存在相同的杂合突变1893-1895delCGA(见图3-10)，是一种新的突变类型。其他进行DNA测序的家庭成员未见以上突变。 2.在家系2的先证者(临床诊断为双侧肾上腺嗜铬细胞瘤)，其兄长(临床诊断为双侧肾上腺嗜铬细胞瘤)及先证者尚未发病的儿子3个家庭成员中，发现了RET原癌基因第11外显子存在相同的杂合突变Cys634Arg(见图11-14)，是文献报道中发生率较高的一种突变类型之一。 3.家系1和家系2的RET原痛基因的突变方式不同，但临床表现相似。发病成员均为中年发病，大部分以双侧肾上腺嗜铬细胞瘤起病；有不同程度的甲状腺异常，或血CT升高伴或不伴甲状腺出现占位性病变，或已确诊为MTC；尽管发现部分成员血iPTH升高，但尚缺少诊断HPT的其他证据。 结论: 1.RET原癌基因第11外显子1893-1895delCGA杂合突变及Cys634Arg杂合突变，均为MEN2A的致病基因，而前者是一种未见报道的新的突变类型。 2.虽然本研究中2个MEN2A家系的RET原癌基因的突变方式截然不同，但两家系发病人员在起病方式、发病年龄及临床表现均相似，考虑与同为11外显子的、位点相近的、编码ret蛋白细胞膜胞外区的密码子发生突变有关。