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目的了解抗生素和质子泵抑制剂联合应用对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的联合抗菌效应;了解外膜蛋白编码基因hefA(outer-membrane proteinhefA gene)表达与贵阳市Hp多重耐药的关系。方法1、采用界值法检测Hp临床菌株对克拉霉素、左氧氟沙星和阿莫西林的敏感性,选取Hp克拉霉素、左氧氟沙星和阿莫西林敏感菌株(n=5)和耐药菌株(n=5),采用棋盘格法检测三种抗生素分别与两种质子泵抑制剂(奥美拉唑、雷贝拉唑)联合应用对Hp的最低抑菌浓度(MIC),通过公式计算FIC指数(Fractional inhibitory concentration Index,FICI),判断药物联合抗菌效应;比较奥美拉唑和雷贝拉唑分别与三种抗生素联合应用时的FICI,采用两小样本t检验的方法进行统计学处理。2、提取耐三种抗生素的多重耐药菌株(n=10)、敏感菌株(n=6)及质控菌株SS1的基因组DNA,PCR扩增hefA基因片段,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,并测序,将测序的基因序列输入NCBI中进行BLAST比对;利用TRIzol试剂提取上述细菌的RNA,逆转录成cDNA,以16sRNA为内参基因,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测hefA基因和内参基因的CT值,通过比较2-AΔCt判断多重耐药菌株和敏感菌株hefA基因表达的差异,以两小样本t检验进行统计学处理。结果1、本实验分离的69株Hp菌株中同时对克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林耐药的多重耐药株为15株,多重耐药率达到21.7%(15/69)。2、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林分别与奥美拉唑、雷贝拉唑配伍对敏感菌株和耐药菌株的联合抗菌作用FICI均小于0.75;雷贝拉唑和左氧氟沙星对敏感菌株的联合抗菌试验FICI比奥美拉唑和左氧氟沙星的联合抗菌试验的FICI小(P=0.035<0.05,两小样本t检验),奥美拉唑和雷贝拉唑分别与克拉霉素或阿莫西林联合抗菌试验的FICI没有显著的差异(P=0.545和0.156>0.05,两小样本t检验);雷贝拉唑和阿莫西林对耐药菌株的联合抗菌试验FICI比奥美拉唑和阿莫西林的联合抗菌试验的FICI小(P=0.012<0.05,两小样本t检验),雷贝拉唑和奥美拉唑分别与左氧氟沙星或克拉霉素联合抗菌试验的FICI没有显著差异(P=0.789和0.461>0.05,两小样本t检验)。3、hefA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳显示,6株敏感菌和10株多重耐药菌及质控SS1菌均有约140bp的扩增产物,测序结果显示均为幽门螺杆菌的hefA基因;通过Real-timePCR在敏感株和多重耐药株中均检测出hefA外排基因的表达,在敏感株中2-ΔΔCt为0.895±0.540,多重耐药株中2-ΔΔC 3.387±1.597,多重耐药株表达量显著高于敏感株(P=0.001<0.05,两小样本t检验)。结论1、奥美拉唑或雷贝拉唑分别与克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林联合应用均有协同抗菌作用。2、雷贝拉唑和左氧氟沙星对敏感株的联合抗菌作用比奥美拉唑和左氧氟沙星的联合抗菌作用强;雷贝拉唑和阿莫西林对耐药菌株的联合抗菌作用比奥美拉唑和阿莫西林的联合抗菌作用强。3、在抗生素与PPI类药物联合应用时,部分耐药菌株可分别表现为对阿莫西林、左氧氟沙星和克拉霉素敏感。4、hefA外排基因的高表达与贵阳地区Hp多重耐药有关。