【摘 要】
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狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus,RABV）引起的高致病性人兽共患传染病,病死率为百分之百。广西是狂犬病老疫区,RABV在广西的流行具有一定的地域特点,因此对广西RABV流行毒株进行流行病学调查,揭示RABV在广西的流行趋势依然是必要的。本研究对2018年来自上林县的咬人疯狗狗脑和宜州市的咬牛疯狗狗脑进行RT-PCR检测,诊断这两份样品均为RABV阳性,然后将分离得到的两株狂犬病野毒
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狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus,RABV）引起的高致病性人兽共患传染病,病死率为百分之百。广西是狂犬病老疫区,RABV在广西的流行具有一定的地域特点,因此对广西RABV流行毒株进行流行病学调查,揭示RABV在广西的流行趋势依然是必要的。本研究对2018年来自上林县的咬人疯狗狗脑和宜州市的咬牛疯狗狗脑进行RT-PCR检测,诊断这两份样品均为RABV阳性,然后将分离得到的两株狂犬病野毒株分别命名为GXSL2018和GXYZ2018。应用设计的全基因组引物扩增出相应的片段,最终获得两株RABV基因组序列,长度均为11923 nt。对GXSL2018和GXYZ2018毒株的全基因组以及五个病毒基因进行遗传进化分析,结果显示两株病毒同属于广西GroupⅡ基因群。GroupⅡ基因群分支内的RABV包含全国多个省份的流行毒株以及东南亚流行毒株。对全基因组氨基酸序列进行比对时发现,RABV各个结构基因的大小以及与病毒毒力相关的重要功能位点都高度保守,但两个新分离的流行毒株GXSL2018和GXYZ2018的3’UTR都在第20位缺失一个核苷酸。RABV侵害人和动物脑组织,造成脑组织损伤,为了探索狂犬病的病理损伤机制,本研究对狂犬病毒株感染小鼠脑进行蛋白质组学分析。根据对GXSL2018和GXYZ2018两株野毒株的分析,发现二者相似度达99.1%,因此在进行蛋白质组学研究时,选择GXSL2018毒株作为研究对象,同时还设定了DMEM空白对照组、r RC-HL弱毒对照组以及CVS-24经典强毒对照组,并对差异蛋白（DEPs）进行GO注释、KEGG注释以及蛋白互作分析。GO数据库,可以将DEPs按照其参与的生物过程（Biological Process,BP）、分子功能（Molecular Function,MF）和细胞组分（Cellular Component,CC）等三个方面分别进行分类注释。r RC-HL vs DMEM组BP富集表明DEPs主要参与免疫反应相关过程,MF富集表明DEPs主要起到抗原结合和免疫球蛋白受体结合作用,CC富集表明DEPs主要是中间丝和吞噬囊泡膜细胞组分。KEGG通路富集发现,r RC-HL vs DMEM组DEPs主要集中在系统性红斑狼疮和单纯疱疹感染等通路。CVS-24 vs DMEM组BP富集表明DEPs主要参与免疫防御反应过程,MF富集表明DEPs主要起蛋白质结合和核酸结合作用,CC富集表明DEPs主要是细胞外空间和血液微粒组分。KEGG通路富集发现,CVS-24 vs DMEM组DEPs主要集中在抗原加工递呈及补体和凝血级联通路。GXSL2018 vs DMEM组BP富集表明DEPs主要参与免疫反应相关过程,MF富集表明DEPs主要起蛋白质结合和核酸结合功能,CC富集表明DEPs主要是细胞外组分和中间细丝组分。KEGG通路富集发现,GXSL2018 vs DMEM组DEPs主要集中在单纯疱疹感染及RIG-I样受体信号通路。在蛋白互作分析基础上,确认进一步对SAA1、GRN和Lgals3三个基因的转录水平进行验证,证实了RABV感染尤其是强毒株感染能够使这3个基因的表达水平显著上升。本研究对Tau蛋白磷酸化水平进行了检测,因为Tau蛋白是一种与细胞微管组装密切相关的含磷糖蛋白,其主要功能是促微管观组装,维持微管的稳定。本研究用r RC-HL、CVS-24、GXSL2018和GXYZ2018等毒株感染小鼠脑,在濒死期时采取脑组织,用特异的Tau蛋白磷酸化位点抗体进行检测,结果表明CVS-24、GXSL2018和GXYZ2018等强毒感染可以导致Tau蛋白在Thr181、Ser416、Ser396和Ser214等位点的发生磷酸化,这些结果可能会破坏神经元的结构和功能,导致神经功能紊乱。但是,关于Tau蛋白磷酸化的机制还有待深入探索。本研究对新分离的广西狂犬病野毒株进行全基因组测序,获得了一些新的数据,对广西狂犬病防控具有重要的参考作用。在此基础上,选择新分离的GXSL2018毒株作为研究对象,进行了病毒感染小鼠脑的蛋白质组学分析,获得了一批病毒——宿主互作的蛋白质变化数据,对研究RABV致病机制提供重要的参考并具有重要的实践意义。
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