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背景：
维甲酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)是存在于胞浆的一类重要模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）。RLR能够识别病毒复制过程中产生的病毒RNA，通过招募下游接头分子线粒体抗病毒信号分子(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)，形成MAVS-TNF受体相关因子3（TNF receptor associated factor3，TRAF3）-TANK结合激酶1（TANK binding kinase1，TBK1）复合体进而激活转录因子IRF3，诱导包括IFN-α和IFN-β在内的Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）表达。分泌的Ⅰ型干扰素进一步与其受体结合，通过Janus激酶(janus kinase，JAK)-信号转导与转录激活因子（signal transducerand activator of transcription，STAT）通路，诱导大量干扰素诱导基因（interferon-stimulated genes，ISGs），从而建立有效的抗病毒状态。DDX3X(DEAD box RNA helicase3，X-linked)是RLR通路的关键接头分子，在形成MAVS-TRAF3复合体的过程中发挥重要的枢纽作用。因此，DDX3X的精确调节对于RLR介导的抗病毒固有免疫应答的适度活化至关重要。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与调节多种蛋白的活化及表达水平;DDX3X是否可发生泛素化修饰，未见报道。E3泛素连接酶MDM2(murine double minute2)是抑癌基因p53的重要负调因子，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。然而，其在固有免疫反应信号通路中的作用，特别是在巨噬细胞等免疫细胞中的功能，尚不清楚。
本研究利用RNA干扰技术、高表达技术，依托RNA病毒感染模型，研究了MDM2在抗RNA病毒固有免疫应答的调控作用及其潜在分子机制。我们发现MDM2通过与DDX3X特异性结合，增强其K63位多聚泛素化修饰，从而促进了RLR介导的抗病毒固有免疫应答。本研究提出了DDX3X的新的调控机制，补充并完善了固有免疫调控网络;揭示了MDM2在抗病毒感染中的作用，为抗病毒药物的研发提供了潜在靶点。
材料和方法：
1.病毒感染对MDM2表达的影响
SeV感染小鼠腹腔巨噬细胞0h，4h，8h，12h，24h，36h，提取细胞裂解物并进行蛋白定量，Western blot检测MDM2蛋白表达水平。
2.MDM2对RLR介导的抗病毒免疫应答的影响
2.1 设计合成Mdm2的特异性干扰RNA（siRNA），利用脂质体Interferin将siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞。36h后，Western blot验证MDM2干扰情况。
使用脂质体Interferin分别将Mdm2及对照（Ctrl）siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，SeV感染细胞8h，提取RNA并反转录，实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Ifnb的mRNA表达水平。
2.2 利用脂质体JetPEI将MDM2表达质粒与IFN-β报告基因质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，SeV感染细胞12h，报告基因检测IFN-β活化水平。
利用脂质体JetPEI将不同剂量的MDM2表达质粒、RIG-Ⅰ的N端截断体质粒与IFN-β报告基因质粒共转染入HEK293T细胞。报告基因检测IFN-β活化水平。
3.MDM2对RLR介导的IRF3活化影响及宿主抗病毒能力的影响
3.1 利用脂质体JetPEI将MDM2表达质粒与IRF3报告基因质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，SeV感染细胞12h，报告基因检测IRF3活化情况。
利用脂质体Interferin分别将Mdm2及Ctrl siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，SeV感染细胞，Western blot检测IRF3及STAT1磷酸化水平。
3.2 使用脂质体Interferin分别将Mdm2及对照（Ctrl）siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，VSV感染细胞8h，提取RNA并反转录，RT-PCR检测Cxcl10表达水平。
4.MDM2促进RLR通路的作用靶点
SeV病毒感染小鼠原代腹腔巨噬细胞，利用MDM2抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测MDM2与DDX3X、TBK1的内源性结合情况。
SeV病毒感染THP-1细胞，利用MDM2抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测MDM2与DDX3X、TBK1的内源性结合情况。
5.MDM2对DDX3X蛋白表达水平的影响
利用脂质体Lipo2000将不同浓度的MDM2质粒与DDX3X质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，Western blot检测DDX3X表达水平。
6.MDM2对DDX3X泛素化水平的影响
利用脂质体Interferin分别将Mdm2及Ctrl siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，SeV感染细胞6h，使用DDX3X抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测DDX3X多聚泛素化修饰情况。
利用脂质体Lipo2000将MDM2、DDX3X及Ub-K63质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，使用DDX3X标签抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测DDX3X多聚泛素化修饰情况。
结果：
1.SeV诱导MDM2表达
小鼠腹腔巨噬细胞感染双链RNA病毒SeV后，MDM2蛋白表达水平显著上调，提示MDM2参与了机体抗病毒固有免疫信号通路的调控作用。
2.MDM2促进IFN-β生成
Mdm2特异性siRNA抑制小鼠巨噬细胞MDM2内源性表达后，SeV感染介导的Ifnb转录明显下调;同时，HEK293T细胞的报告基因实验显示，高表达MDM2可显著提高SeV及RIG-Ⅰ介导的IFN-β报告基因活性。结果说明MDM2可以促进RNA病毒介导的固有免疫应答及IFN-β生成。
3.MDM2促进IRF3活化及抗病毒能力
MDM2高表达则显著上调SeV诱导的IRF3报告基因活化;Mdm2siRNA抑制内源性MDM2表达后，SeV感染诱导的转录因子IRF3磷酸化水平明显下调。此外，Mdm2基因敲低后，SeV介导的IFN-β下游STAT1磷酸化水平降低;VSV介导的干扰素诱导基因Cxcl10表达降低。以上结果表明，MDM2可促进RNA病毒介导的IRF3活化，并通过JAK-STAT通路增强下游抗病毒能力。
4.MDM2与DDX3X特异性结合
在小鼠腹腔巨噬细胞及人THP-1细胞中，MDM2可与RLR通路中关键接头分子DDX3X持续性结合，提示MDM2调控RLR信号通路的作用靶点为DDX3X。
5.MDM2不影响DDX3X表达
HEK293T细胞中，DDX3X的表达水平不随MDM2的表达而改变。这一结果表明，MDM2并不能通过影响DDX3X的降解从而调节RLR信号通路。
6.MDM2促进DDX3X K63位多聚泛素化修饰
SeV感染后，DDX3X的泛素化修饰显著增强，而当Mdm2敲低后，这一现象被抑制;进一步研究发现，高表达MDM2显著促进DDX3X K63位多聚泛素化修饰。结果表明，MDM2可靶向DDX3X并介导其K63位多聚泛素化修饰。
结论：
E3泛素连接酶MDM2可特异性结合RLR信号通路关键接头分子DDX3X，介导其K63位多聚泛素化修饰，从而促进RLR介导的IRF3活化及IFN-β生成。
创新性及研究意义：
1.RLR信号通路中关键接头分子DDX3X可发生K63偶联的泛素化修饰，E3泛素连接酶MDM2介导了这一过程;揭示了DDX3X活化的调节机制，丰富了对固有免疫调控网络的认知。
2.MDM2通过促进DDX3X泛素化，增强RLR信号通路活化。揭示了癌基因MDM2在固有免疫反应中的调控作用，为研制抗病毒药物提供了潜在靶点。
维甲酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)是存在于胞浆的一类重要模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）。RLR能够识别病毒复制过程中产生的病毒RNA，通过招募下游接头分子线粒体抗病毒信号分子(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)，形成MAVS-TNF受体相关因子3（TNF receptor associated factor3，TRAF3）-TANK结合激酶1（TANK binding kinase1，TBK1）复合体进而激活转录因子IRF3，诱导包括IFN-α和IFN-β在内的Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）表达。分泌的Ⅰ型干扰素进一步与其受体结合，通过Janus激酶(janus kinase，JAK)-信号转导与转录激活因子（signal transducerand activator of transcription，STAT）通路，诱导大量干扰素诱导基因（interferon-stimulated genes，ISGs），从而建立有效的抗病毒状态。DDX3X(DEAD box RNA helicase3，X-linked)是RLR通路的关键接头分子，在形成MAVS-TRAF3复合体的过程中发挥重要的枢纽作用。因此，DDX3X的精确调节对于RLR介导的抗病毒固有免疫应答的适度活化至关重要。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，参与调节多种蛋白的活化及表达水平;DDX3X是否可发生泛素化修饰，未见报道。E3泛素连接酶MDM2(murine double minute2)是抑癌基因p53的重要负调因子，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。然而，其在固有免疫反应信号通路中的作用，特别是在巨噬细胞等免疫细胞中的功能，尚不清楚。
本研究利用RNA干扰技术、高表达技术，依托RNA病毒感染模型，研究了MDM2在抗RNA病毒固有免疫应答的调控作用及其潜在分子机制。我们发现MDM2通过与DDX3X特异性结合，增强其K63位多聚泛素化修饰，从而促进了RLR介导的抗病毒固有免疫应答。本研究提出了DDX3X的新的调控机制，补充并完善了固有免疫调控网络;揭示了MDM2在抗病毒感染中的作用，为抗病毒药物的研发提供了潜在靶点。
材料和方法：
1.病毒感染对MDM2表达的影响
SeV感染小鼠腹腔巨噬细胞0h，4h，8h，12h，24h，36h，提取细胞裂解物并进行蛋白定量，Western blot检测MDM2蛋白表达水平。
2.MDM2对RLR介导的抗病毒免疫应答的影响
2.1 设计合成Mdm2的特异性干扰RNA（siRNA），利用脂质体Interferin将siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞。36h后，Western blot验证MDM2干扰情况。
使用脂质体Interferin分别将Mdm2及对照（Ctrl）siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，SeV感染细胞8h，提取RNA并反转录，实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Ifnb的mRNA表达水平。
2.2 利用脂质体JetPEI将MDM2表达质粒与IFN-β报告基因质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，SeV感染细胞12h，报告基因检测IFN-β活化水平。
利用脂质体JetPEI将不同剂量的MDM2表达质粒、RIG-Ⅰ的N端截断体质粒与IFN-β报告基因质粒共转染入HEK293T细胞。报告基因检测IFN-β活化水平。
3.MDM2对RLR介导的IRF3活化影响及宿主抗病毒能力的影响
3.1 利用脂质体JetPEI将MDM2表达质粒与IRF3报告基因质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，SeV感染细胞12h，报告基因检测IRF3活化情况。
利用脂质体Interferin分别将Mdm2及Ctrl siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，SeV感染细胞，Western blot检测IRF3及STAT1磷酸化水平。
3.2 使用脂质体Interferin分别将Mdm2及对照（Ctrl）siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，VSV感染细胞8h，提取RNA并反转录，RT-PCR检测Cxcl10表达水平。
4.MDM2促进RLR通路的作用靶点
SeV病毒感染小鼠原代腹腔巨噬细胞，利用MDM2抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测MDM2与DDX3X、TBK1的内源性结合情况。
SeV病毒感染THP-1细胞，利用MDM2抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测MDM2与DDX3X、TBK1的内源性结合情况。
5.MDM2对DDX3X蛋白表达水平的影响
利用脂质体Lipo2000将不同浓度的MDM2质粒与DDX3X质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，Western blot检测DDX3X表达水平。
6.MDM2对DDX3X泛素化水平的影响
利用脂质体Interferin分别将Mdm2及Ctrl siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后，SeV感染细胞6h，使用DDX3X抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测DDX3X多聚泛素化修饰情况。
利用脂质体Lipo2000将MDM2、DDX3X及Ub-K63质粒共转染入HEK293T细胞。24h后，使用DDX3X标签抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测DDX3X多聚泛素化修饰情况。
结果：
1.SeV诱导MDM2表达
小鼠腹腔巨噬细胞感染双链RNA病毒SeV后，MDM2蛋白表达水平显著上调，提示MDM2参与了机体抗病毒固有免疫信号通路的调控作用。
2.MDM2促进IFN-β生成
Mdm2特异性siRNA抑制小鼠巨噬细胞MDM2内源性表达后，SeV感染介导的Ifnb转录明显下调;同时，HEK293T细胞的报告基因实验显示，高表达MDM2可显著提高SeV及RIG-Ⅰ介导的IFN-β报告基因活性。结果说明MDM2可以促进RNA病毒介导的固有免疫应答及IFN-β生成。
3.MDM2促进IRF3活化及抗病毒能力
MDM2高表达则显著上调SeV诱导的IRF3报告基因活化;Mdm2siRNA抑制内源性MDM2表达后，SeV感染诱导的转录因子IRF3磷酸化水平明显下调。此外，Mdm2基因敲低后，SeV介导的IFN-β下游STAT1磷酸化水平降低;VSV介导的干扰素诱导基因Cxcl10表达降低。以上结果表明，MDM2可促进RNA病毒介导的IRF3活化，并通过JAK-STAT通路增强下游抗病毒能力。
4.MDM2与DDX3X特异性结合
在小鼠腹腔巨噬细胞及人THP-1细胞中，MDM2可与RLR通路中关键接头分子DDX3X持续性结合，提示MDM2调控RLR信号通路的作用靶点为DDX3X。
5.MDM2不影响DDX3X表达
HEK293T细胞中，DDX3X的表达水平不随MDM2的表达而改变。这一结果表明，MDM2并不能通过影响DDX3X的降解从而调节RLR信号通路。
6.MDM2促进DDX3X K63位多聚泛素化修饰
SeV感染后，DDX3X的泛素化修饰显著增强，而当Mdm2敲低后，这一现象被抑制;进一步研究发现，高表达MDM2显著促进DDX3X K63位多聚泛素化修饰。结果表明，MDM2可靶向DDX3X并介导其K63位多聚泛素化修饰。
结论：
E3泛素连接酶MDM2可特异性结合RLR信号通路关键接头分子DDX3X，介导其K63位多聚泛素化修饰，从而促进RLR介导的IRF3活化及IFN-β生成。
创新性及研究意义：
1.RLR信号通路中关键接头分子DDX3X可发生K63偶联的泛素化修饰，E3泛素连接酶MDM2介导了这一过程;揭示了DDX3X活化的调节机制，丰富了对固有免疫调控网络的认知。
2.MDM2通过促进DDX3X泛素化，增强RLR信号通路活化。揭示了癌基因MDM2在固有免疫反应中的调控作用，为研制抗病毒药物提供了潜在靶点。