论文部分内容阅读
肝素是临床中使用历史悠久的抗凝药物,它主要是通过与抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)结合后与凝血因子十因子(FXa)生成三元络合物,发挥抗凝血作用的。然而,肝素与ATⅢ的结合物还可以与凝血酶Ⅱa因子结合生成三元络合物,导致出血等副作用。依诺肝素,作为重要的低分子量肝素之一,由肝素降解所得,分子量较小,其在一定程度上保持了与ATⅢ和FXa因子结合成三元络合物达到抗凝血作用的能力,同时极大减少了其与ATⅢ结合后和凝血酶Ⅱa形成复合物的能力,进而降低了其临床出血副作用的风险。目前,依诺肝素在实际临床使用中被广泛应用。肝素是由重复二糖单元组成的直链多糖物质,主要的二糖单元是2-硫酸化艾杜糖醛酸1,4连接6,N-硫酸化氨基葡萄糖(约占60-70%),同时还含有多种少量其它二糖单元。较大的分子量和不均一的分子量分布、复杂的糖基组成和不完全硫酸化使得肝素结构异常复杂。依诺肝素相对于肝素虽然分子量减小了,但由于工艺原因糖链末端增加了不饱和糖醛酸和2-5位脱水结构,这使得依诺肝素的结构较肝素更加复杂和多样。在此前提下,依诺肝素中复杂的糖链体系与ATⅢ结合情况研究对阐述依诺肝素的有效性和安全性就显得格外重要。但是,由于依诺肝素结构的复杂性和微不均一性以及其分析方法的限制等原因,目前针对依诺肝素中与ATⅢ不同亲和力组分的结构研究仍然十分有限。为了对比依诺肝素中与ATⅢ具有不同亲和力的依诺肝素组成的结构差异,找出其抗凝活性的发挥与其结构之间的关系,本课题建立了亲和层析系统来分离制备与ATⅢ具有不同亲和力的依诺肝素钠组分,并对不同组分进行初步的活性验证以及结构解析,进一步探索了依诺肝素抗凝活性及结构之间的关系,为依诺肝素结构解析、质量监控、一致性评价工作奠定理论基础。1.本课题通过对亲和层析系统中的ATⅢ蛋白制品、亲和层析色谱规格等进行了筛选,最终建立了亲和层析制备系统,并成功分离收集了一定量与ATⅢ具有低、中、高亲和力的依诺肝素组分。2.对制备所得的依诺肝素组分进行初步的活性验证和结构解析,其活性测试结果显示随着依诺肝素组分与ATⅢ亲和力的提高,其抗FXa活性也随之增强。3.本课题利用肝素酶降解后的强阴离子分离高效液相分析法、多反应检测扫描-三重四极杆质谱分析法(MRM-QQQ)等对不同依诺肝素组分进行了细致的结构解析,其结果显示,不同组分的二糖寡糖组成呈现一定的差异及规律,虽然各组分降解产物中主要组成仍是8个常见肝素二糖,但随着依诺肝素组分与ATⅢ亲和力的提高,其二糖组成含量有所降低,其含有三位硫酸化的不能被肝素酶彻底降解的四糖含量随之增加,这为依诺肝素抗凝血活性的发挥与其结构之间的关系的验证提供了一定依据。