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研究背景：鼻咽癌(nasopharyngeal cancer, NPC)是发生于鼻咽上皮的恶性肿瘤,常见于我国南方地区,尤其在广东地区高发。鼻咽癌的病因及发病机制尚未完全明了,其发病与饮食习惯、环境、基因、EB病毒感染等多种因素相关。虽然NPC的5年生存率通过放化疗等综合治疗有了很大提高,但远期预后仍然不良,约55%的NPC在治疗后5年出现复发转移,并且很多病人存在放化疗抵抗。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)理论认为肿瘤复发转移以及对放化疗的耐受等均与CSC相关。由于肿瘤干细胞的存在使得当前的治疗无法根除实体瘤,虽然治疗可以缩小转移瘤体积,但不久就会复发。研究表明CSC是一小部分具有高增殖能力、自我更新潜能和多向性分化能力的细胞亚群,并有放化疗抵抗的特性,这些特点与普通干细胞甚至胚胎干细胞相似。正常情况下干细胞的分化、更新能力受到信号传导通路的严格调控,一旦信号传导通路成分的突变或表达失调,这种调控机制异常或被破坏,细胞就会异常分化,无限制生长繁殖,形成CSC并发生肿瘤。同样的CSC也处在一系列信号传导通路的调控网络中,研究表明肿瘤细胞、干细胞、CSC信号传导通路之间可能拥有共同的途径,如Wnt、Notch、SHH、BMP、PI3K/Akt、Bmil信号途径等。目前常用的CSC鉴定方法为SP (side population)细胞检测法,本研究通过检测鼻咽癌细胞株的SP细胞数量来观察鼻咽癌肿瘤干细胞数量变化情况。Wnt/β-catenin信号通路不仅存在于正常干细胞中,对细胞维持自我更新、抑制分化、增殖迁徙及凋亡起到重要作用,也可能在控制未成熟的CSC方面起关键作用,在许多肿瘤的CSC中发现Wnt/β-catenin信号通路介导耐药及肿瘤复发。近年来研究发现在皮肤癌中β-catenin信号可特异地维持CSC表型,去除β-catenin基因可导致CSC的丢失及肿瘤退化。在皮肤癌中β-catenin高表达,但在正常上皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路并非必须,利用这种机制上的差异可定向地消灭CSC,达到治愈皮肤鳞癌的目的。我们最近研究表明β-catenin在鼻咽癌中介EGFR/PTEN/Akt的信号,对维持CSC特性起着十分关键的作用。因此研究β-catenin与鼻咽癌CSC的关系,可为特异性抑制鼻咽癌CSC提供新的思路,通过沉默鼻咽癌细胞β-catenin基因表达而使其失去干细胞特性,可为NPC的CSC分子靶向治疗提供新的靶点,为新型抗肿瘤药物应用于临床实践提供理论支持。目的：建立稳定抑制(?)β-catenin基因表达的人鼻咽癌细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号通路与鼻咽癌肿瘤干细胞之间的关系提供细胞模型,以期为鼻咽癌的基因治疗找到新的靶点。方法：1。构建稳定干扰β-catenin的CNE-2细胞株利用RNAi技术,针对β-catenin CTNNB1基因构建2对shRNA’漫病毒表达载体,感染人鼻咽癌细胞株CNE-2后有效沉默β-catenin mRNA的表达,经Western-blot检测β-catenin在目的细胞中表达水平,获得稳定干扰β-catenin表达的CNE-2细胞株。2.于细胞水平检测β-catenin对鼻咽癌CSC的影响及调节机制1)WB检测目的细胞中干细胞标记物c-myc、OCT3/4及EMT相关标记物E-cadherin、Vimentin的表达；2)MTT及Transwell检测干扰β-catenin后肿瘤细胞的增殖及迁移能力；3)IF检测目的细胞中干细胞标记物c-myc、Nanog、OCT3/4、Sox2、EpCAM及EMT相关标记物Vimentin的表达；4) FACS检测细胞周期及SP细胞比例。3.体内试验用干扰β-catenin表达后的鼻咽癌细胞株接种至裸鼠皮下,测量肿瘤体积并绘制生长曲线。分离肿瘤组织并进行1)成瘤组织HE染色；2)IHC检测成瘤组织中β-catenin及SOX2干细胞标记物表达。4.本课题所用的统计学方法采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。每组细胞MTT所测吸光度值以均数±标准差(x±s)表示,各组比较采用析因设计的方差分析,固定因素水平下做One—Way ANOVA,若方差齐性取F值,若方差不齐则采用Welch值,多重比较在方差齐性时采用LSD检验,方差不齐时采用Dunnett T3法,P<0.05为差异有统计学意义。Transwell实验中穿膜细胞数目采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较各组差异,若方差齐性取F值,若方差不齐则采用Welch值,多重比较在方差齐性时采用LSD检验,方差不齐时采用Dunnett T3法,P<0.05为差异有统计学意义。细胞周期检测采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较各组差异,组间的多重比较采用LSD检验；裸鼠皮下成瘤实验不同组间肿瘤体积的比较采用重复测量的方差分析。结果：1.构建稳定干扰β-catenin的CNE-2细胞株：pLVTHM-sh-β-catenin转入细胞表达效率检测：含pLVTHM-sh-β-catenin质粒的慢病毒载体感染CNE-2细胞48h后,用倒置荧光显微镜观察病毒转染效率,克隆扩大培养后得到稳定表达绿色荧光的细胞,表明慢病毒载体构建成功。2.于细胞水平检测β-catenin对鼻咽癌CSC的影响及调节机制1) Western blot检测P-catenin蛋白的表达：Western blot检测结果显示干扰组1(pLKO.l-sh-β-catenin)及干扰组2 (pLVTHM-sh-β-catenin)抑制效果不同,相对于空白对照组及阴性对照组细胞,干扰组1干扰效率最佳,β-catenin蛋白表达明显下降；干扰组2的β-catenin蛋白表达有部分下降。实验结果表明成功构建了稳定抑制β-catenin的CNE-2细胞株。选择抑制效率最高的干扰组1检测β-catenin沉默后干细胞标记物c-myc、Oct3/4,EMT标记物Vimentin和E-cadherin。结果显示相对于未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组,P-catenin下调后c-my、Oct3/4、Vimentin蛋白表达明显降低,E-cadherin表达增高。2)细胞增殖检测：干扰组1细胞增殖能力较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组降低,差异有统计学意义(P<0.001)；未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组之间差异无统计学意义(P=0.098)。表明CNE-2细胞内β-catenin基因表达抑制后细胞增殖能力也受到抑制。3)细胞迁移能力检测：Transwell小室实验结果中干扰组1、未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组穿膜细胞数分别为(23.5±4.6)、(54.3±5.6)和(50.3±5.3)个,干扰组1穿膜细胞数较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组明显降低,差异有统计学意义(P<0.001),未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组之间无统计学意义(P=0.096)。4)免疫荧光检测：免疫荧光技术检测干扰组1、未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组细胞中β-catenin、c-myc、Nanog、OCT3/4、Sox2及Vimentin、EpCAM等表达情况,干扰组1细胞中β-catenin、c-myc、Nanog、OCT3/4、Sox2、EpCAM及Vimentin表达较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组细胞明显降低,未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组之间无明显差别。3)细胞周期干扰组1较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组出现G1期阻滞：干扰组1和未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组相比G1期细胞比例显著增加(P=0.001、P=0.007)S期细胞比例显著下降(P=0.001、P=0.002)。干扰组1的SP细胞较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组明显减少。3.于体内检测β-catenin对CSC增殖及迁移能力的影响重复测量方差分析显示三组间主效应差异显著(F=66.432,P=0.000),经析因设计的方差分析DunnenttT3比较结果显示干扰组1组较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组肿瘤体积在不同时间测量差异显著(P=0.001,P=0.002),未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组肿瘤体积在不同时间测量无显著性差异(P=0.882)。1)HE染色：光镜下未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组可见大量坏死,肿瘤细胞排列成腺样结构,核异型性明显,细胞核大深染；干扰组1坏死组织较少(肿瘤生长慢),肿瘤细胞排列成片巢状分布。2)IHC检测未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组部分区域灶状表达干细胞标记物SOX2,主要为核表达,干扰组1中几乎未见SOX2表达。3)IHC检测未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组中β-catenin有细胞膜、胞浆及胞核表达,干扰组1中组织内几乎未见β-catenin表达。结论：本文设计了2个β-catenin CTNNB1基因干扰靶点,成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,利用pLKO.l载体上嘌呤霉素抗性基因筛选获得了低表达β-catenin基因的人鼻咽癌细胞株。P-catenin基因表达抑制的干扰组1细胞内c-myc、Oct3/4、Vimentin蛋白表达明显降低,E-cadherin表达增高。MTT对β-catenin基因表达抑制的干扰组1细胞株分析显示P-catenin基因表达抑制后癌细胞数量明显减少,说明细胞增殖能力减弱。Transwell小室实验结果示干扰组1穿膜细胞数较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组明显降低,免疫荧光检测干扰组1细胞中β-catenin、c-my、Nanog、OCT3/4、Sox2、EpCAM、Vimentin表达较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组细胞明显降低,未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组之间无明显差别。细胞周期干扰组1较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组出现G1期阻滞；干扰组1的SP细胞较未处理组及pLKO.l-sh-ctrl组明显减少。成瘤实验证实干扰组1肿瘤生长受到抑制,干扰组1中β-catenin及SOX2表达明显降低。抑制鼻咽癌细胞株内β-catenin表达可抑制Wnt通路,减低细胞增殖及侵袭能力,使细胞阻滞于G1期；可减少肿瘤干细胞(SP细胞)的数目,降低肿瘤干细胞标志物的表达,并使肿瘤生长受到抑制。