论文部分内容阅读
目的：肝细胞生长因子可以促进细胞的分裂、再生和运动，它及其受体c-Met异常高表达在卵巢癌进展中起重要作用。凋亡抑制蛋白XIAP在卵巢癌的发生中也有着一定的关系，但关于三者在卵巢癌中的调控的研究目前尚未见报道。本实验运用免疫组织化学检测HGF及c-Met在卵巢癌中的表达情况，再运用c-Met的特异性抑制剂PHA665752作用于卵巢癌SKOV-3后，观察细胞增殖情况、凋亡改变及对XIAP的影响。为卵巢癌临床治疗提供理论依据。方法：（1）免疫组织化学染色（EnVision法）及Image-ProPlus图像分析软件，观察HGF及其受体在卵巢浆液性囊腺癌组织、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢交界性肿瘤和正常卵巢组织中的蛋白表达。（2）以人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV-3为研究对象，首先在37℃，5%CO2，20%O2和95%湿度条件下培养卵巢癌细胞，提取生长指数期细胞，且生长良好的细胞进行以下实验。以不同浓度（0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml）的HGF和（0.5umol/l、1umol/l、2umol/l）的PHA665752作用细胞后，于不同时间（24h、48h、72h）收集细胞，使用MTT法、流式细胞术AnnexinV-FITC/PI法检测各组卵巢癌细胞的增殖及凋亡情况。（3）PT-PCR、Western Blot检测PHA6657522umol/l、HGF40ng/ml作用细胞48小时后XIAP、HGF、c-Met的改变情况。（4）所得数据以错误！未找到引用源。表示，多组间均数比较采用方差分析，p<0.05有统计学意义，统计使用SPSS17.0软件处理。结果：（1）卵巢良性肿瘤HGF、c-Met的表达水平相对于正常对照组来说，增高不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），阳性率是20％、20％；卵巢恶性肿瘤HGF、c-Met的表达水平相对于良性肿瘤来说，增高明显，差异有统计学意义（P＜0.05），阳性率是60％、70％。（2）不同浓度（0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml）的HGF和（0umol/l、0.5umol/l、1umol/l、2umol/l）的PHA665752对卵巢癌存活率的影响：24h分别为（44.58%、53.77%、59.94%、63.97%）和（60.05%、57.31%、52.05%、44.58%）；48h分别为（38.48%、84.33%、84.48%、81.85%）和（57.05%、46.72%、39.28%、37.66%）；72h分别为（29.26%、30.18%、31.23%、32.28%）和（49.26%、39.28%、32.41%、34.43%）。20ng/ml HGF随作用时间延长，细胞增殖无明显改变，差异无统计学意义（p>0.05）；而40ng/ml、80ng/mlHGF随作用时间延长，细胞存活率增高，各组比较有统计学差异（p<0.05）；当作用24小时后随着浓度增加，存活率无明显改变，差异无统计学意义（p>0.05）；当作用时间延长48h、72h，存活率随浓度的提高而增加，差异有统计学意义（p<0.05）。不同浓度的PHA665752作用24h后细胞增殖活性无明显改变，统计学比较无差异（p>0.05）；而在48h、72h时随着浓度的增加（1umol/l、2umol/l），细胞存活率减少，各组比较有统计学差异（p<0.05）；0.5umol/lPHA665752随着作用时间延长，细胞增殖活性也无明显改变，统计学比较无差异（p>0.05），而1umol/l、2umol/lPHA665752随着作用时间的延长，细胞存活率下降，各组比较有统计学差异（p<0.05）。（3）不同浓度（0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml）的HGF和（0.5umol/l、1umol/l、2umol/l）的PHA665752对卵巢癌凋亡率的影响：24h分别为（13.63%、13.27%、13.51%、13.20%）和（9.71%、10.33%、14.13%、15.61%）；48h分别为（14.37%、13.75%、9.87%、10.90%）和（10.66%、15.49%、30.61%、19.26%）；72h分别为（14.18%、12.26%、11.45%、13.76%）和（14.09%、17.45%、27.19%、20.28%）。HGF实验组24h各浓度组间凋亡率无明显差异，统计学比较无差异（p>0.05），而在48h、72h随着HGF浓度增加（40ng/ml、80ng/ml），细胞凋亡降低，统计学比较有差异（p<0.05）。PHA665752相同浓度时，随着作用时间的延长，细胞凋亡率增加，其差异有统计学意义（p<0.05）；0.5umol/lPHA665752作用24h后细胞凋亡率无明显改变，差异无统计学意义（p>0.05），而在48h、72h是随着浓度增加1umol/l、2umol/l，凋亡率增加，其差异有统计学意义（p<0.05）。（4）空白对照组HGF mRNA相对表达含量为0.88±0.11、c-Met mRNA相对表达含量为0.85±0.14、XIAP mRNA相对表达含量为0.92±0.08，实验组HGF40ng/ml对卵巢癌SKOV3作用48h后，HGF mRNA相对表达含量为1.32±0.25、c-Met mRNA相对表达含量为1.69±0.16、XIAP mRNA相对表达含量为1.92±0.07；PHA6657521umol/l对卵巢癌SKOV3作用48h后，HGF mRNA相对表达含量为0.71±0.16、c-Met mRNA相对表达含量为0.49±0.05、XIAP mRNA相对表达含量为0.42±0.02。PHA665752处理组中各蛋白比空白组相对表达量低，其差异有统计学意义（p<0.05），HGF处理组中各蛋白比空白组中相对表达量高，其差异有统计学意义（p>0.05）。（5）空白对照组XIAP蛋白表达量0.70±0.05，HGF处理组XIAP蛋白表达量0.99±0.03，PHA665752处理组XIAP蛋白表达0.34±0.03。HGF处理组XIAP蛋白表达量比空白组高，其差异有统计学意义（p<0.05）、PHA665752处理组XIAP蛋白表达量比空白组低，其差异有统计学意义（p<0.05）。空白对照组c-Met蛋白表达量0.69±0.03，HGF处理组c-Met蛋白表达量1.00±0.03，PHA665752处理组c-Met蛋白表达0.35±0.05。HGF处理组c-Met蛋白表达量比空白组高，其差异有统计学意义（p<0.05）、PHA665752处理组c-Met蛋白表达量比空白组低，其差异有统计学意义（p<0.05）。结论：（1）HGF、c-Met、XIAP在恶性卵巢癌中高表达。（2）PHA665752可抑制c-Met，可使HGF/c-Met信号通路下调，从而使HGFmRNA、c-MetmRNA、XIAPmRNA表达减少，蛋白表达量也减少，最终导致卵巢癌SKOV3细胞增殖减少，凋亡增加。（3）HGF能使HGFmRNA、c-MetmRNA、XIAPmRNA表达增加，蛋白表达量也增加，促进卵巢癌SKOV3细胞生长。可见，卵巢癌SKOV3细胞中HGF、c-Met、XIAP表达水平受HGF/c-Met通路的调控。