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油菜是我国第一大自产油料作物,随着国民生活水平不断提高,人们对食用油的品质提出了新的要求,品质改良已成为当前油菜育种领域的热点。传统育种技术耗时长,为加快育种进程,可利用分子生物学方法研究脂肪酸合成机理。本实验室前期利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）技术对油酸含量不同的甘蓝型油菜近等基因系（HOCR,油酸含量81.4%;LOCR,油酸含量56.2%）授粉后20～35 d种子进行分析,发现4个脂肪酸合成相关关键差异蛋白,均为乙酰化蛋白,推测脂肪酸代谢可能与乙酰化修饰相关。本论文中,以相同材料进行乙酰化修饰测序分析,采用蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）和实时荧光定量法验（Quantitative Real-time PCR,qPCR）证测序结果;筛选得到一个脂肪酸代谢相关蛋白对应基因BnaACP3并克隆,采用重叠引物PCR法往其CDS序列中引入一个碱基突变,定向改变其中一个氨基酸;分别构建了三个基因(BnaACP363K、BnaACP363R与BnaACP363Q)的过表达载体并转化拟南芥,具体结果如下:1.对一组油酸含量不同的甘蓝型油菜近等基因系自花授粉20～35 d混合种子进行乙酰化测序分析,以油酸含量低的甘蓝型油菜品系（LOCR）为对照,1.3倍为变化阈值,t检验p值＜0.05为标准,在具有定量信息的1,409个蛋白质的2,473个位点中,有80个位点显著上调,21个位点显著下调,经生物信息学分析后,筛选得到11个关键差异蛋白:3个与脂肪酸代谢（GSBRNA2T00153661001、GSBRNA2T00054708001、GSBRNA2T00100854001）、4个与糖酵解（GSBRNA2T00076479001、GSBRNA2T00069603001、GSBRNA2T00108116001、GSBRNA2T00009340001）、3个与光合作用（GSBRNA2T00134966001、GSBRNA2T00024656001、GSBRNA2T00141918001）以及1个与植物逆境生理相关（GSBRNA2T00129427001）。2.为了验证测序结果,选择一个差异表达组蛋白（H3K27ac）,以同批送测序样品为材料,采用WB方法进行验证,发现在HOCR材料中的表达情况要高于LOCR,符合测序结果;选出8个差异表达蛋白对应基因（BnaC03g33080D、BnaA06g36060D、BnaC09g16320D、BnaC09g07990D、BnaA01g30320D、BnaA02g27140D、BnaC04g33690D、BnaC09g29010D）以相同材料进行qPCR验证,发现这8个基因在HOCR材料中的表达量均高于LOCR,与测序结果一致。上述结果表明,本研究中乙酰化修饰测序结果可靠。3.采用qPCR法将选出的11个差异蛋白对应基因（BnaC03g33080D、BnaA06g36060D、BnaC09g16320D、BnaA01g30320D、BnaA02g27140D、BnaC04g33690D、BnaC09g29010D、BnaC09g07990D、BnaA06g01050D、BnaA03g15830D、BnaA09g33250D）,在两个材料苗期、5～6叶期、蕾薹期叶、盛花期的花和角果期种子（授粉后20～35 d）研究其表达情况,结果表明这11个基因在HOCR材料的苗期至蕾薹期间,均呈现先升高后下降的表达趋势。在苗期,5～6叶期和成熟期种子中的表达量均要高于LOCR材料,且在5～6叶期的表达量要高出LOCR很多,可用于早期筛选。BnaA06g36060D、BnaC09g07990D、BnaA01g30320D、BnaA02g27140D、BnaC04g33690D、BnaC09g29010D、BnaA03g15830D和BnaA09g33250D基因在HOCR材料5个时期的表达量均高于LOCR,表明在HOCR中的代谢可能要比在LOCR中的高。4.以HOCR苗期叶片为材料,用PCR扩增克隆法获得BnaACP363K,并通过重叠引物PCR法在其第63号位引入一个碱基突变,成功获得氨基酸定向突变的BnaACP363R和BnaACP363Q。生物信息学分析表明这3个碱基序列与数据库公布序列同源性在98%以上,氨基酸序列在99%以上,编码的氨基酸均为131个,分子量约14.1 kDa,不稳定系数大于40,等电点均在5以下,是为不稳定疏水性酸性蛋白质,且定位在叶绿体上,无跨膜结构。3级模型预测表明这三个蛋白均属于PP-binding super family超基因家族。氨基酸序列聚类分析表明,与拟南芥、琴叶拟南芥、荠菜和亚麻芥亲缘关系较近。5.利用双酶切法构建植物表达载体pCAMBIA1300-BnaACP363K,pCAMBIA1300-BnaACP363R和pCAMBIA1300-BnaACP363Q,经PCR和双酶切验证表明,载体构建成功。将这3个表达载体转化农杆菌感受态,在拟南芥中进行转化实验。