目的1.探索复杂性外阴阴道念珠菌病患者临床治疗经济有效的方案。2.研究复合维生素B辅助治疗外阴阴道念珠菌病的意义。3.通过小鼠念珠菌感染模型,阴道上皮细胞与念珠菌共培养及体外氟康唑药物敏感实验探索复合维生素B在辅助治疗阴道念珠菌感染中的重要辅助作用。4.为临床治疗复杂性外阴阴道念珠菌病提供新的治疗理论和探索更经济有效的临床治疗方法。方法1.问卷调查及药敏试验:本部分研究中共有164人填写了调查表。填写基本情况,目的了解RVVC的发病人群的基本特征;记录随访表格内容,分别于治疗结束后1-2周、1、3、6月随访,建议就诊时间及治疗后3、6个月阴道分泌物真菌培养+药敏,跟踪记录治疗方案的有效性。2.临床研究:按照随机对照的原则,严格按照纳入标准,共纳入参与治疗的门诊病人158例,随机分为三组进行治疗与随访。A组49例:阴道内局部栓剂1周+口服抗真菌药4周（咪康唑栓每晚1粒×1周+氟康唑150mg每周1次×4次）;B组54例:阴道内局部栓剂1周+外阴阴道局部药膏4周（咪康唑栓每晚1粒×1周+复方酮康唑乳膏每晚外阴阴道局部用×4周）;C组55例:阴道内局部栓剂1周+阴道局部药膏4周+口服复合维生素B 2周（咪康唑栓每晚1粒×1周+复方酮康唑乳膏每晚外阴阴道局部用×4周+复合维生素B一次2片,一天两次×2周）;患者治疗期间禁止性生活一周,即阴道用栓剂期间,禁性生活一周。为便于随访及及时了解情况,将随访者电话给患者,并随时提供心理疏导。将资料效果分为四个等级。治愈:在治疗后的6个月内,患者症状及各种体征消失,白带中念珠菌的检查呈阴性;显效:在治疗后的6个月内,患者症状及各种体征明显好转,白带中念珠菌的检查呈阴性;好转:在治疗后的6个月内,患者症状及各种体征有一定改善,白带中念珠菌的检查呈阴性;无效:在治疗后的6个月内,患者症状及各种体征无改善或加重,白带中念珠菌的检查呈阳性。有效率比较用卡方检验。3.实验室研究:3.1病理动物模型的构建与鉴定:ICR品系雌性小鼠105只,鼠龄8-10周,体重22.31±3.26g鼠验。标准饲料饲养时间大于1周,经后腿皮下注射苯甲酸雌二醇造成小鼠处于假发情状态,两天注射一次,每次0.1mg,共3次。在注射的第6天将接种白念珠菌液注入手术吸收性止血海绵中并塞于小鼠阴道内,接种后的第2、4、7、21天选取5只小鼠,用100μl的PBS灌洗阴道并取阴道组织。灌洗液一部分稀释通过改良沙堡葡萄糖琼脂培养基接种培养进行cfu计数,一部分浓度梯度稀释后涂布到念珠菌显色培养基上用于鉴定阴道念珠菌感染的动物模型。3.2实验分组及处理方法:所有小鼠在成功造模21天后（为治疗第1天）,均采用氟康唑150μl/次经灌胃治疗,1、4、7天各1次,之后1次/周×3次。同时联合腹腔注射复合维生素B辅助治疗,根据复合维生素B的用量情况进行随机分4组,每组模型组小鼠20只:V1对照组,经腹腔注射生理盐水150μl;V2组,经腹腔注射复合维生素B注射液50μl+100μl生理盐水;V3组,经腹腔注射复合维生素B注射液100μl+50μl生理盐水;V4组,经腹腔注射复合维生素B注射液150μl。治疗4周后,各组取小鼠的阴道分泌物涂片镜检,取阴道组织做组织病理,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片,行HE染色。3.3阴道上皮细胞培养及念珠菌感染阴道上皮细胞模型的建立与分组:用组织块法和含表皮生长因子的角化细胞无血清培养基体外培养人阴道上皮细胞,细胞传代后与白色念珠菌孢子共培养,24小时后再加入50μl氟康唑,之后根据加入的复合维生素B剂量不同分成四组:V1对照组（15μl PBS）,V2组（10μl PBS+5μl复合维生素B）,V3组（5μl PBS+10μl复合维生素B）,V4组（15μl复合维生素B）48小时收集各组的细胞上清液分析炎症因子IL-1β,IL-6和IL-8的水平。3.4氟康唑抗真菌体外敏感实验:用96孔培养板,将稀释到10³CFU/ml的念珠菌菌液加如下4组溶液中,V1组（15μl RPMI-1640）,V2组（10μl RPMI-1640+5μl复合维生素B）,V3组（5μl RPMI-1640+10μl复合维生素B）,V4组（15μl复合维生素B）,再将配置好不同浓度的氟康唑溶液（2.0μg/ml,1.8μg/ml,1.6μg/ml,1.4μg/ml,1.2μg/ml,1.0μg/ml,0.8μg/ml,0.6μg/ml,0.4μg/ml,0.2μg/ml）,加入V2,V3,V4组中,分析氟康唑MIC₈₀（抑制80%细菌生长的氟康唑浓度）。4.统计学方法:所有数据通过SPSS21.0统计学软件进行分析,统计疗效时痊愈、显效、好转合并为有效率。计数资料结果采用均数±标准差（（?）±S）表示,两组之间采用独立样本t检验,P<0.05差异有统计学意义。结果1.临床调查随访表:164例女性患者中,年龄最小21岁,最大50岁,发病主要集中25-45岁之间,占84.2%,82.3%的患者在病程中有过自我诊断和治疗,76.8%患者伴有焦虑与紧张,61.6%分娩方式为顺产,采用避孕套和宫内节育器避孕的患者各占34.8%和37.2%,有阴道冲洗习惯的占22%,18.9%的患者近期使用过抗生素,14.6%患者有其他部位的真菌感染,有过口交和肛交性行为的占12.8%,12.8%的患者性伴侣有类似的症状。2.临床研究:2.1 158例念珠菌阳性患者感染白色念珠菌的患者占129例（81.6%）,非白色念珠菌感染的患者占29例（18.4%）;118例（91.5%）白色念珠菌对氟康唑敏感,18例（62.1%）非白色念珠菌对氟康唑敏感;白色念珠菌对氟康唑的敏感、中介及耐药率分别为91.5%,5.3%,3.2%;非白色念珠菌对氟康唑的敏感、中介及耐药率分别为62.1%,24.8%,13.1%;治疗RVVC临床常用的抗真菌药物氟康唑和伊曲康唑总的敏感度分别可达86.1%和62%,耐药率6.1%和7.2%;非白色念珠菌在氟康唑耐药方面明显高于白色念珠菌,具有有统计学意义（P<0.01）。2.2三组患者经过临床治疗效果有统计学上的显著差异,C组总的有效率92.7%,明显高于A组73.5%和B组79.6%（P<0.05）,C组治愈率达72.7%,也高于A组61.2%和B组63.0%,但无显著统计学差异（P>0.05）。3.动物研究3.1 VVC小鼠造模成功感染率为95.23%,白色念珠菌感染的小鼠观察21天,接种后的第2天显微镜下即能看到白色念珠菌的孢子和假菌丝,第4天能够观察到接种小鼠在接种4天开始出现阴道分泌物增多、外阴充血、水肿现象。小鼠接种感染的第2天显色培养基的菌落形成为2.99±0.32 CFU/ml,第4天达到高峰7.28±0.55CFU/ml,然后开始缓慢下降,第7天为4.96±0.24 CFU/ml,第21天为3.13±0.19CFU/ml。3.2经灌胃及腹腔注射给药治疗4周后,阴道分泌物涂镜检查发现,V1组小鼠的阴道分泌物在显微镜下可见明显的假菌丝,聚集成团,芽生孢子丰富,V2组能看到明显的芽生胞子,假菌丝不成团簇状;V3组仅见少量的菌丝和孢子,V4组镜下看不到假菌丝,孢子偶见。3.3经灌胃及腹腔注射给药治疗4周后,阴道组织病理切片染色发现:染色后能够看到小鼠阴道粘膜组织有菌丝的粘着和入侵,V1组阴道组织中严重充血水肿,急性炎性浸润,在粘膜和粘膜下可见较多炎性细胞,而随着复合维生素B的用量增加,V2组与V3组炎症反应逐渐减少,V4组仅有轻度水肿没有炎性浸润（P<0.01）。3.4四组VVC小鼠治疗方案的有效率和治愈率比较:V1组的有效率60%和治愈率30%,随着复合维生素B的用量的增加,V4组有效率达90%和治愈率达65%,而V2组有效率70%和治愈率40%,V3组有效率85%和治愈率50%。组间有显著性差异（P<0.05）。3.5四组VVC小鼠治疗后的阴道组织用ELISA法分析炎症因子IL-1β,IL-6,和IL-8的水平,V1组分别为308.1±23.65ng/l,93.85±4.92 ng/l,135.65±14.13 ng/l,V2组分别为199.65±21.43ng/l,71.05±3.95ng/l,96.55±16.27ng/l,V3组分别为205.31±22.18ng/l,68.34±3.25ng/l,89.09±13.05ng/l,V4组分别为118.16±21.52ng/l,55.49±2.41ng/l,66.0±12.92ng/l,V1组炎症反应相对其他组都有显著偏高,明显高于其他三组,V4组的三种炎症因子的水平明显降低。3.6与念珠菌共培养的阴道上皮细胞在加入不同剂量的复合维生素B后48小时,收集各组的细胞上清液分析和IL-1β,IL-6和IL-8的水平,V1组明显高于其他三组,分别为418.25±22.75ng/l,99.48±4.43 ng/l,155.74±11.11 ng/l随着复合维生素B的增加,上清液中炎症因子的水平明显降低。3.7氟康唑抗真菌体外敏感实验,没有加复合维生素B的念珠菌培养孔中氟康唑MIC₈₀为2.0μg/ml,随着复合维生素B量的增加氟康唑MIC₈₀下降到1.2μg/ml。结论1.临床研究:1.1 RVVC的易感菌群仍然是以白色念珠菌为主,占81.6%,其次是非白色念珠菌,占18.4%;白色念珠菌对氟康唑的敏感性可达91.5%,非白色念珠菌对氟康唑的敏感性为62.1%,非白色念珠菌对氟康唑耐药明显高于白色念珠菌。结合中华医学会妇产科分会感染协作组关于复发性外阴阴道假丝酵母菌病（RVVC）诊治指南,我们认为氟康唑目前可以作为RVVC的治疗首选药物之一。同时建议对治疗效果不满意者应注意非白念珠菌感染的和白色念珠菌耐药的可能,及时进行药物敏感实验、更换治疗方案。1.2目前临床治疗RVVC的方案不统一,临床治疗效果不满意,需要进一步探索。咪康唑栓每晚1粒×1周+复方酮康唑乳膏每晚外阴阴道局部用×4周+复合维生素B一次2片,一天两次×2周的治疗方案是有效率和治愈率更好的方案,花费少,易于为患者接受,减少抗真菌药物的使用,值得推广。2.实验室研究:从治疗后小鼠VVC模型阴道分泌物涂片、阴道组织的病理表现、炎症因子的生成量、证实用不同方案治疗VVC小鼠,复合维生素B辅助治疗能够明显提高治疗的有效率和治愈率,与念珠菌的体外共培养阴道上皮细胞的炎症因子的生成量,提示复合维生素B能够调节阴道上皮细胞的免疫反应。此外,氟康唑抗真菌体外敏感实验提示复合维生素B可以加强氟康唑抑制真菌的效应。