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目的: TRE17癌基因最早发现于人Ewings肉瘤,由TBC1D3基因和USP32基因融合而成,在多种肿瘤如平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、肾癌和膀胱癌中高表达,其过量表达可使正常成纤维细胞Nm3T3发生恶性转化。细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网架体系,细胞骨架发生异常,可造成细胞黏附能力下降、运动能力增强等,引起细胞恶性转化为肿瘤细胞,导致肿瘤的发生。为了阐明TRE17的功能和其导致细胞恶性转化的机制,为人类肿瘤的诊断、治疗提供新线索,我们初步探讨TRE17与细胞骨架蛋白MLC2、β-Tubulin(TubB2C)之间的相互作用。
方法:为研究癌基因TRE17与细胞骨架蛋白MLC2、β-Tubulin相互作用,我们先将原核表达质粒pGEX-6P-1、pGEX-MLC2和pGEX-TubB2C重组质粒分别导入大肠杆菌BL21,并经异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST、GST-MLC2和GST-TubB2C蛋白后,在非变性条件下(1％NP40裂解液和超声破碎仪)裂解细菌菌体,再分别将GST、GST-MLC2和GST-TubB2C蛋白用Glutathione Sepharose4B进行亲化。
用LipofectamineTM(Invitrogen)将真核表达质粒HA-TRE17／pcDNA3截短体转染培养的COS-7细胞4-5h。换新鲜培养基继续培养20～24h后,加入细胞裂解液(0.1％NP40、20mmol／LTris-HCl(pH8.0)、150mM Kcl、2mM EDTA、5mM DTT、10％(v／v)甘油、蛋白酶抑制剂),收取细胞裂解物。以GST蛋白为对照,将纯化的GST-MLC2、GST-TubB2C蛋白与该转染细胞裂解物进行GST pull-down分析,用抗HA抗体进行Western Blot分析,以检测沉淀中的HA-TRE17蛋白。
结果:大肠杆菌BL21在分别用pGEX-6P-1、pGEx-MLC2和pGEX-TubB2C转化后,由IPTG诱导表达的蛋白分子量是28.AkDa(GST蛋白)、46.6kDa(GST-MLC2融合蛋白)和78kDa[GST-TubB2C融合蛋白),而未转入任何质粒的BL21和转入pGEX-6P-1或pGEX-MLC2、pGEX-TubB2C质粒而未经IPTG诱导的BL21阴性对照,则在相应分子量处仅见非常弱的非特异性蛋白条带。在非变性条件下,GST、GST-MLC2和GST-TubB2C蛋白被用GlutathioneSepharose4B进行亲和纯化后,纯度可达90％。
以GST蛋白为对照,用GST-MLC2、GST-TubB2C融合蛋白与经HA-TRE17／pcDNA3截短体转染培养的HEK293细胞裂解物进行GST Pull-down实验后,用抗HA抗体进行Western Blot分析,显示在GST和GST-MLC2、GST-TubB2C蛋白使用量基本一样时,阴性对照GST蛋白并不结合TRE17(447)蛋白,TubB2C蛋白与TRE17(447)结合,表明TubB2C蛋白可特异性结合TRE17蛋白；MLC2蛋白结合TRE17(375)、TRE17(242)、TRE17(174),表明MLC2与TRE17结合,结合区域可能在TRE17氨基端的174个氨基酸以内。
结论:
1.本实验通过体外表达和纯化GST和GST-MLC2蛋白,用GST Pull-down实验证实TRE17癌蛋白能特异性结合MLC2蛋白,结合区域可能位于TRE17氨基端的174个氨基酸以内；
2.本实验通过体外表达和纯化GST和GST-TubB2C蛋白,用GST Pull-down实验初步证实TRE17癌蛋白能特异性结合beta微管蛋白2C。