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肩袖疾病（rotator cuff disease, RCD）是引起肩周疼痛、肩关节功能障碍的最常见原因。随着细胞生物学和分子生物学的发展，我们对于肩袖疾病形成机理及有了更深入的认识。逐渐认识到：肩峰下滑囊炎（subacromial bursitis）是导致肩袖疾病患者肩痛及功能障碍的重要原因。肩峰下滑囊细胞是肩峰下滑囊炎的核心细胞，非特异性刺激（机械牵拉、缺氧、炎性细胞及临近肩袖腱细胞）可通过囊壁上的压力或化学感受器刺激其分泌IL-1、TNF-α，MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2、SDF-1、P物质及VEGF多种炎性因子形成了一个调控慢性炎症反应的网络，而IL-1β及TNF-α是这个炎性网络的关键因子。遗憾的是，尽管大理的研究都证实了这些细胞因子对肩峰下滑囊炎的起病与发展起到了十分重要的作用，但大都仅局限在机制的探讨上，尚未有应用这些因子治疗肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的相关报道。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是含有21～23bp的双链RNA,可以序列特异性地切割靶RNA,介导转录后基因沉默，抑制蛋白质的合成，而不诱导非特异性的双链RNA反应。近年来，RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在基因治疗领域发展极为迅速。到目前为止，国内外尚未有应用RNAi技术肩袖疾病的相关报道。本实验中，我们利用siRNA双靶向干扰肩峰下滑囊细胞的IL-1β及TNF-α基因，评价IL-1β及TNF-α基因剔降效果及对这个炎性网络中其它炎性因子的影响。目的旨在明确肩峰下滑囊细胞类型及病理特征；探讨利用RNAi手段沉默人肩峰下滑囊细胞IL-1β及TNF-α基因的可行性；评价IL-1β及TNF-α基因剔降效果及对这个炎性网络中其它炎性因子的影响；进一步揭示肩袖疾病肩峰下滑囊炎发病机制及IL-1β及TNF-α在其炎性环路中的作用；为肩袖疾病临床治疗、未来基因治疗及药物筛选提供重要理论依据。方法1.取肩袖疾病患者肩峰下滑囊标本，通过平面培养的方法，采用改良双酶消化法分离、体外培养、纯化肩峰下滑囊细胞，观察细胞形态，通过H-E染色、Vimentin及CD68免疫荧光染色鉴定明确细胞类型。2.设计合成针对人IL-1β基因序列特征设计特异siRNA-(1-3)，及针对人TNF-α基因序列特征设计特异siRNA-(a-c)，以阳离子脂质体为载体，转染体外培养的肩峰下滑囊细胞；FAM荧光标记，测定转染率，观察转染后细胞形态。Westen blot筛选出针对IL-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，进一步通过Realtime-PCR检测siRNA抑制肩峰下滑囊细胞IL-1β及TNF-α基因表达效果及剂量、时间相关性。3.利用筛选出的针对IL-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，双靶向干扰肩峰下滑囊细胞，Realtime-PCR检测IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2及SDF-1等细胞因子表达水平，以不加siRNA的滑囊细胞做空白对照，评价IL-1β及TNF-α基因剔降后对这个炎性网络中其它炎性因子的影响。结果1.人肩峰下滑囊原代细胞贴壁良好。传至第3代后以长梭形细胞均匀生长。HE染色，普通光镜下，细胞呈梭型，核呈圆形，较大，核仁明显，免疫荧光结果显示Vimentin阳性，CD68阴性，符合成纤维样滑膜细胞特征。2. FAM荧光标记后测定转染率都在80％以上，观察转染后细胞形态及生长均无明显影响；Westen blot结果显示IL-1β-siRNA-2及TNF-α-siRNA-c相对基因抑制水平最强；Realtime-PCR检测显示siRNA抑制肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞IL-1β及TNF-α基因表达时存在相似的剂量、时间相关性，随siRNA终浓度增加，抑制效率增强；转染后24h抑制最强，48h后逐渐减弱。3. siRNA-2、siRNA-c均以终浓度200nmol／L同时转染肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞，以不加siRNA的滑囊细胞做空白对照，Realtime-PCR结果显示：转染后IL-1β及TNF-α的表达被明显抑制。MMP-1、MMP-9、COX-1的抑制效果同对照组相比有显著差异， COX-2、SDF-1的抑制效虽不显著，但仍有抑制。结论1.采用改良双酶消化法可成功扩增并获得相当数量的肩峰下滑囊细胞。2.经鉴定，肩峰下滑囊细胞培养至第3代为纯度较高的成纤维样滑膜细胞。3.化学合成的IL-1β、TNF-α特异siRNA通过脂质体瞬时转染可以有效抑制肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞IL-1β、TNF-α基因的表达。4. siRNA抑制肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞IL-1β及TNF-α基因均存在良好的剂量、时间相关性。5.利用siRNA双靶向干扰技术可成功剔降IL-1β、TNF-α基因的表达，并同时下调了炎性网络中炎性因子MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2及SDF-1的表达。对炎性网络有明确的抑制作用。6.从另一面证实了在肩峰下滑囊炎炎性网络中，IL-1β、TNF-α作为关键因子与其它炎性因子存在正反馈关系。7.应用RNAi技术对肩峰下滑囊炎慢性炎症反应环路中的多个靶点进行调控可能是未来治疗肩峰下滑囊炎乃至肩袖疾病的有效途径。