坝上高寒区孢囊线虫种类鉴定及生防真菌的筛选

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孢囊线虫是危害作物的重要病原物之一,在我国发生较为严重的是大豆孢囊线虫和禾谷孢囊线虫,导致作物生长缓慢、矮小瘦弱、叶片发黄,根系不发达,在须根上可观察到乳白色至淡黄色雌虫。在坝上高寒区,尚缺乏对孢囊线虫种类、寄主范围、生理小种和生防真菌的系统研究。本研究调查了坝上高寒区孢囊线虫的种类,采用形态学和分子生物学方法进行鉴定;通过盆栽试验测定甜菜孢囊线虫的寄主范围;采用雌虫指数法鉴定大豆孢囊线虫的生理小种类型;采用直接分离法和选择性培养基法分离大豆孢囊线虫生防真菌,通过测定菌株对孢囊、卵和二龄幼虫的寄生性以及菌株发酵液对二龄幼虫活性进行初筛,对初筛菌株进行杀线虫谱、盆栽和田间试验进行复筛,对获得的生防真菌进行形态和分子鉴定;通过高通量测序评估生防真菌对土壤微生物群落的影响。主要研究结果如下:1.2016~2017年,在坝上高寒区张家口市和承德市的31村9种作物根际采集到158份土壤样品,通过漂浮分离法获得6个孢囊线虫群体,通过形态学和分子生物学鉴定,群体ZM、KM、CB和FN为大豆孢囊线虫(Heterodera glycines),孢囊密度分别为57、41、103和31个/200 mL 土样;群体ZY为禾谷孢囊线虫(H.avenae),孢囊密度为68个/200 mL 土样;群体ZZ为甜菜孢囊线虫(H.schachtii),孢囊密度为 94 个/200 mL 土样。2.在中国,首次发现甜菜孢囊线虫危害白菜,并通过柯赫氏法则进行验证。甜菜孢囊线虫可侵染白菜玲珑黄012,大豆中黄十三,菜豆白丰、白不老、九粒白,西葫芦京葫十二和早青一代,番茄中杂9号,黄瓜中农18,油菜绿冠一号和本氏烟。在白菜玲珑黄012根内观察到二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫和雌虫,是甜菜孢囊线虫的适宜寄主。大豆中黄十三,菜豆白丰、白不老、九粒白,西葫芦京葫十二和早青一代,番茄中杂9号,黄瓜中农18,油菜绿冠一号和本氏烟不是甜菜孢囊线虫的适宜寄主。白菜春黄金、金利、金圣、金鸣、塞北金美、福莱美,甘蓝中甘21、中甘15、奥奇娜,娃娃菜金王子,花椰菜白云341,西兰花碧峰、中青11号、耐寒优秀,油菜翠英252,拟南芥,胡萝卜黑田五寸参、菲瓦特,芹菜玉皇、文图拉,甜椒金袋、中椒5号,马铃薯荷兰十五,番茄百利、格雷,茄子高朗、俊朗、园杂5号,菜豆泰国架豆王,生菜射手101和大葱铁杆王不是甜菜孢囊线虫的寄主。3.采用国际通用鉴定方法-雌虫指数法,对大豆孢囊线虫4个群体进行生理小种鉴定,大豆孢囊线虫群体ZM(采自张家口市张北县馒头营乡李森林村)、KM(采自张家口市康保县满德堂乡大四段村)和CB(采自张家口市察北管理区)均为4号生理小种,FN(采自承德市丰宁满族自治县)为3号生理小种。4.采用直接分离法和选择性培养基法,从大豆孢囊线虫孢囊、卵和二龄幼虫、根际土壤中分离获得141株真菌分离物。选取菌落形态不同的25株菌株测定对孢囊、卵和二龄幼虫的寄生性,6个菌株可寄生孢囊,菌株L4和Y2的寄生率是100%。菌株L4寄生后孢囊壁消解破裂,露出卵;菌株Y2作用后孢囊壁逐渐消解。菌株L4和Y2寄生卵后,卵壳逐渐消解。菌株HL、BM1、BM4、L3、L4、Y2和BL2对二龄幼虫有抑杀作用,菌株L4、Y2和BL2作用24h后虫体僵直,丧失活动能力,48h后被菌丝覆盖;菌株HL、BM1、BM4和L3作用48h后丧失活动能力,虫体僵直。25株真菌发酵液对大豆孢囊线虫二龄幼虫均有抑制活性。菌株JGZ、L4、Y2、BL2和BJ的校正死亡率均高达90%,L4和Y2效果较好,分别为97.44%和97.80%。JGZ和Y2作用60 h时校正死亡率最高,其余菌株作用48 h时校正死亡率最高。经菌株发酵液作用后,二龄幼虫内含物消解速度加快,虫体逐渐透明,菌株L4效果最明显,虫体几乎透明。经初筛,菌株JGZ、BL2、L4、Y2和BJ综合防效较好。5.5株初筛真菌JGZ、BL2、L4、Y2和BJ发酵液对大豆孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、禾谷孢囊线虫和腐烂茎线虫均有一定抑制活性,随着稀释倍数的增加,抑制活性降低。菌株JGZ、BL2、L4、Y2和BJ的5X发酵稀释液对大豆孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、禾谷孢囊线虫的校正死亡率均达90%,菌株L4对大豆孢囊线虫的校正死亡率最高,为95.95%,对腐烂茎线虫的校正死亡率为77.27%,菌株L4的20X发酵稀释液对大豆孢囊线虫的校正死亡率仍高达92.31%。盆栽穴施菌株JGZ、BL2、L4、Y2和BJ发酵液均可降低大豆孢囊线虫的孢囊数量,对大豆株高无显著影响,菌株L4和Y2处理根长和茎粗显著高于其他处理。菌株L4和Y2的盆栽防效分别为43.67%和41.87%,与其他处理差异显著。田间单独施用L4发酵浓缩液拌种对大豆孢囊线虫的防效为35.83%,与化学药剂1.8%阿维菌素乳油的防效41.67%无显著差异,通过形态学和分子生物学鉴定,菌株L4为哈茨木霉(Trichoderma harzianum),哈茨木霉L4可有效防治大豆孢囊线虫。6.高通量测序结果表明,田间施用哈茨木霉L4大豆根际土壤中有益微生物放线菌门、酸杆菌门、叶杆菌属和曲霉属的丰度增加。本研究在坝上高寒区采集158份土壤样品,分离获得6个孢囊线虫群体,群体ZM、KM、CB和FN为大豆孢囊线虫,群体ZY为禾谷孢囊线虫,群体ZZ为甜菜孢囊线虫。在中国,首次发现甜菜孢囊线虫危害白菜,白菜玲珑黄012是甜菜孢囊线虫的适宜寄主。大豆孢囊线虫群体ZM、KM和CB为4号生理小种,FN为3号生理小种。哈茨木霉L4发酵原液对大豆孢囊线虫二龄幼虫的校正死亡率为97.44%,盆栽防效为43.67%,田间施用哈茨木霉L4发酵浓缩液拌种,对大豆孢囊线虫的防效为35.83%,与1.8%阿维菌素乳油的防效无显著差异,大豆根际土壤中有益微生物的丰度增加。
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