莠去津属三氮苯类除草剂,是目前我国及世界范围内玉米田的一种常规且低成本的主要除草剂之一,用于防治一年生禾本科和阔叶杂草,由于药效佳且价格低廉,自被开发以来逐渐成为全球范围内使用量最大的除草剂之一。随着莠去津的大量和广泛使用,其在环境中的残留对人类等非靶标生物的健康和环境生态系统安全的影响日益备受关注。莠去津的长残效特点会对小麦、大豆等敏感作物产生严重药害,还对地下水和地表水造成严重污染。因此,开发高效灵敏的莠去津检测技术对实时监测环境中的痕量污染物至关重要。基于纳米抗体的酶联免疫分析技术具有高效、快速、灵敏、即时等优点,且在一定程度上弥补了精确高效的大型仪器法无法用于现场快速检测的不足,使农药等环境污染物的高效快速检测得到迅速发展。然而,目前基于酶联免疫技术的各种莠去津检测方法均是依赖于多克隆抗体或单克隆抗体,国内外尚未有报道基于纳米抗体检测环境中的莠去津。本研究基于上述问题,以莠去津作为研究对象开展相关研究,主要研究内容如下:1.通过免疫美洲驼获得多克隆抗体,建立了一种基于多克隆抗体的莠去津酶联免疫检测方法。首先,通过预选美洲驼,选出了机体免疫反应强且对载体蛋白无背景的美洲驼进行免疫,收集抗血清并成功建立了基于美洲驼多克隆抗体的莠去津酶联免疫分析方法,通过棋盘法确定最佳包被抗原为浓度1.00 μg/mL,抗血清稀释倍数为50 000倍,最优NaCl浓度为0.200 mol/L,最优甲醇浓度为5%,最佳缓冲液pH值为7.4,间接竞争酶联免疫反应的抑制中浓度（IC50）为12.13 ng/mL,线性检测范围为5.982～32.48 ng/mL,最低检测限为0.0516 ng/mL;选择其他三种三氮苯类除草剂及常见环境代谢物进行了多克隆抗体的特异性试验,多克隆抗体对特丁津的交叉反应率最高为95.8%,对西玛津为53.1%,对去异丙基莠去津为40.5%,对其他化合物的交叉反应率均较低;从环境中取3处河流水进行了实际样品的添加回收试验,试验结果与LC-MS 比对,添加回收率在90.1%～114%之间,说明开发的基于驼源多克隆抗体的莠去津ic-ELISA方法可用于检测环境实际样品。2.通过噬菌体展示技术获得了针对莠去津的纳米抗体,并优化纳米抗体产量可达16 mg/L。在预选美洲驼基础上,利用制备的免疫原进行美洲驼免疫。收集第五次免疫后的外周血提取淋巴细胞,提取总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板进行了两轮PCR;第一轮扩增所有重链抗体（VHs和VHHs）的可变结构域,第二轮使用3对引物,分别扩增IgG2、IgG3b和IgG3a中的纳米抗体片段以增加噬菌体展示文库的多样性。在此基础上,同时使用同源包被和异源包被进行固相淘选,包被浓度、洗液中吐温20浓度及洗板次数递增,洗脱所用莠去津浓度逐轮递减,通过苛刻的淘选条件成功淘选出针对莠去津的纳米抗体。使用自主开发的纳米抗体浓度测试方法对纳米抗体原核表达和纯化过程中的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导浓度、诱导时间及诱导温度进行了优化,确定最优的IPTG浓度为1.0 mM,最佳诱导时间为16 h,最佳诱导温度为30℃,同时对比了 B-Per裂解法与超声波裂解法,结果表明B-Per裂解效率高于超声波裂解法;对比了 PBS和PB两种不同缓冲液对纯化的影响,结果表明PB缓冲液更适用于纯化纳米抗体,优化后纳米抗体产量可达16 mg/L。3.构建了基于纳米抗体的莠去津酶联免疫分析方法并通过分子对接,预测了纳米抗体与小分子化合物结合的关键氨基酸位点。首先,通过棋盘法确定了最佳包被抗原浓度为1.00 μg/mL,最佳纳米抗体浓度为1.20 μg/mL,反应体系中最佳NaCl浓度为0.400 mol/L,最佳甲醇浓度为5%,最佳缓冲液pH值为7.4,此时IC50为7.732 ng/mL,线性检测范围为5.460～10.70 ng/mL,最低检测限为0.0213 ng/mL;同时进行了特异性试验,测试了纳米抗体对其他三种三氮苯类除草剂及常见环境代谢物的交叉反应,结果表明特丁津的交叉反应率最高为78.8%,对西玛津为26.19%,对去异丙基莠去津为27.25%,对其他化合物交叉反应率较低;从环境中取3处河流水进行了实际样品的添加回收试验,试验结果与LC-MS 比对,添加回收率在97.2%～114%之间,说明开发的莠去津ic-ELISA方法可用于检测环境实际样品。为初步探究纳米抗体特异性识别莠去津的机理,基于纳米抗体的氨基酸序列利用计算机技术进行同源模建,经ERRAT打分、模型Procheck评估和模型Verify3D评估后得到高质量模型,将纳米抗体与莠去津及其他交叉反应率较高的小分子化合物进行分子对接,预测了纳米抗体与小分子化合物的关键结合氨基酸位点。4.开发了一种针对纳米抗体浓度的双抗体夹心酶联免疫分析方法。分别两种抗体作为检测抗体,当使用HRP标记的抗VHH鼠单抗为检测抗体时,最佳捕获抗体浓度为2.50 mg/L,最佳NaCl浓度为0.400mol/L,最佳甲醇浓度为5%,最佳缓冲液pH为7.4,此时EC50值为18.71 ng/mL,检测范围为2.0～31.25 ng/mL;当使用HRP标记抗HA二抗为检测抗体时,最佳捕获抗体浓度为1.00 mg/L,最佳NaCl浓度为0.400 mol/L,最佳甲醇浓度为5%,最佳缓冲液pH为7.0,此时EC50值为2.145 ng/mL,检测范围为0.5～5 ng/mL;同时使用该方法对3-PBA纳米抗体,mEH纳米抗体和BSA进行交叉反应试验,结果表明开发的纳米抗体浓度分析方法可用于其他纳米抗体的浓度测试。综上所述,本研究通过免疫美洲驼,建立了一种基于多克隆抗体的莠去津酶联免疫检测方法,为后续驼源多克隆抗体的应用提供了思路和经验;通过噬菌体展示技术,成功淘选获得了 8株纳米抗体;并基于纳米抗体氨基酸序列,利用计算机技术进行了同源模建,获得高质量模型,将纳米抗体与莠去津及其他交叉反应率较高的小分子化合物进行分子对接,预测了纳米抗体与小分子化合物的关键结合氨基酸位点;通过商业化的针对纳米抗体的鼠单抗,开发了一种检测纳米抗体浓度的双抗夹心酶联免疫分析方法,实现了纳米抗体的精确定量分析。