猪乙型脑炎和猪细小病毒病都是引起母猪繁殖障碍的重要传染病，流行于世界各地大多数猪群，给猪场造成极大经济损失，严重制约养猪业发展。目前国内外防控此类传染病主要依靠疫苗接种，但迄今为止由于市场上仅有商品单苗而无联苗，因而使猪场疫苗的免疫接种不仅过于频繁、费工费时、成本增加，而且也加大了对猪群的各种应激。因此，猪病防控工作中亟需一针防多病的联合疫苗。作者正是以研发猪乙型脑炎-细小病毒病二联灭活疫苗为目标，完成了以下研究工作。一、建立了检测猪乙型脑炎病毒的SYBR Green I荧光定量PCR方法。研究根据乙型脑炎病毒（JEV）NS3基因保守序列设计并合成一对引物，以构建的重组质粒作为阳性标准品，建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测JEV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法在1.92×108～1.92×101copies/μL范围内具有良好的线性关系，可检测到初始模板中19copies/μL的病毒核酸，敏感性是常规RT-PCR方法的10倍；检测时间缩短了50%。该方法不与其它猪源病毒发生交叉反应；在重复性试验中，批间、批内变异系数均小于1.2%。二、用SYBR Green I荧光定量PCR方法研究了猪乙型脑炎病毒的体外复制动态。试验将JEV接种BHK-21细胞，在接毒后13个检测点分别取细胞上清液和混悬液，用上述建立的荧光定量PCR和TCID50方法分别测定了猪乙型脑炎病毒拷贝数和TCID50并绘制增殖动态曲线进行比较分析。结果显示，荧光定量PCR和TCID50方法测定的结果有一定的相关性，在BHK-21细胞接种JEV后28h内，细胞混悬液中JEV的病毒效价一直呈直线上升趋势，且细胞上清中的TCID50效价一直低于细胞混悬液。接毒后28h时细胞混悬液中的病毒效价达到最高点，比细胞上清中早了4h。接毒后32～40h细胞上清和混悬液中病毒效价一直维持在108.0/mL左右；接毒后40h～44h开始下降，接毒后44h～52h较快下降。这与显微镜下细胞的病变情况也相一致，从而确定JEV在BHK-21细胞上的最佳收毒时间为接毒后28h～40h，为疫苗生产过程中病毒增殖滴度的实时检测及最佳收毒时间的确定提供了快速、便利、准确的方法。三、研究了猪乙型脑炎病毒LS株的理化特性和免疫特性。结果表明反复冻融3次对病毒活力影响不大，但该毒株不耐高温，在56℃水浴中30min即可被灭活。该病毒对酸敏感，在pH=5的环境中（37℃,1h）能被灭活，但在pH=8的碱性环境中（37℃,1h）仍具有较高的病毒活力。对乙醚、胰蛋白酶敏感，提示在毒株保存的过程中，避免接触乙醚，在细胞传代的过程中要避免接触到胰蛋白酶。乙型脑炎病毒LS株在pH=6.2～6.4的条件下有凝集鹅红细胞的特性，血凝效价可以达到28。通过免疫原性试验，发现利用猪乙型脑炎病毒LS株制备的灭活疫苗，免疫小鼠后，能够诱导较高的LAT抗体水平（1:64）。猪乙型脑炎病毒LS株的理化特性和免疫特性的研究为猪乙型脑炎疫苗候选株的筛选提供了参考。四、制备了猪乙型脑炎-细小病毒病二联灭活疫苗。利用实验室自行分离鉴定的猪乙型脑炎病毒LS株与猪细小病毒HNZK-1株，分别在BHK-21细胞和PK-15细胞上传代，扩增出高滴度的病毒液，浓缩之后，作为疫苗抗原，经甲醛灭活后，将两种病毒液按照体积比1:1的比例进行混合，与油乳剂乳化后制成猪乙型脑炎-细小病毒病二联灭活疫苗。经过疫苗的物理性状、无菌检验和安全检验后，将疫苗免疫小鼠和豚鼠，结果在2免后4W免疫二联苗小鼠产生的抗猪乙型脑炎病毒的乳胶凝集抗体水平达到高峰（1:51），和自制单苗的抗体水平相当（1:51）且高于商品疫苗产生的乳胶凝集抗体峰值（1:10）；在2免后6W，免疫二联苗的豚鼠产生的抗猪细小病毒的HI抗体水平达到高峰（1:2048），和自制单苗的HI抗体峰值一致（1:2048）且略高于猪细小病毒病商品单苗（1:1024）。