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研究背景三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancers TNBC）是指一种不表达雌激素受体（estrogen receptor ER）、孕激素受体（progestrone receptor PR）和人类表皮生长因子受体2亚型（human epithelial growth factor receptor 2 Her-2）的乳腺癌亚型。TNBC具有发病年龄较小、侵袭性强、恶性程度高、预后差等特点。由于其不表达ER, PR和Her-2往往较早发生侵袭和转移而且对内分泌治疗和抗Her-2的靶向治疗效果差,其治疗手段相对于其他乳腺癌亦相应受到限制。抑癌基因启动子区CpG异常甲基化在多种肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件,也是肿瘤发生的一个早期敏感指标。在基因甲基化过程中,EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）能够通过募集DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferasel, DNMT1）催化抑癌基因发生异常甲基化,从而沉默抑癌基因的表达,并能促进多种恶性肿瘤转移。本课题旨在探索TNBC中EZH2、DNMT1表达之间的联系及与三阴性乳腺癌临床病理参数之间的关系,并探究EZH2及DNMT1表达与抑癌基因甲基化间的相互关系。对TNBC发病机制提供进一步的认识,为其预防治疗以及预后的判断提供更可靠的依据。目的通过检测131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌及65例癌旁组织中EZH2及DNMT1蛋白的表达情况,探讨EZH2及DNMT1蛋白的表达特点及与三阴性乳腺癌主要临床病理参数的关系。方法收集、筛选广州金域医学检验中心2008年1月至2013年5月乳腺癌病理资料较齐全的石蜡包埋标本209例（131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌）,癌旁乳腺组织65例（距离肿瘤边缘4cm以上）。采集患者年龄、是否绝经、肿瘤病理类型、组织学级别、肿瘤大小、有无淋巴结转移、有无脉管神经浸润等资料。采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase SP）法,检测131例三阴性乳腺癌、78例非三阴性乳腺癌及65例癌旁组织中EZH2及DNMT1的蛋白表达情况。运用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采用χ2检验对计数资料进行分析比较,采用多因素Logistic回归分析EZH2及DNMT1阳性表达有关的因素,Spearman等级相关分析三阴性乳腺癌中EZH2及DNMT1表达的相关性。结果EZH2蛋白在三阴性、非三阴性乳腺癌组织和癌旁组织的阳性表达率分别为86.3%、89.7%和40.0%；DNMT1蛋白在三种组织中的阳性表达率分别为63.4%、66.6%和44.6%；两种蛋白在乳腺癌组织中的表达均高于癌旁组织差异具有统计学意义（P<0.05）；三阴性乳腺癌中,EZH2阳性表达与组织学分级、肿瘤直径及淋巴结转移有关（P<0.05）,DNMT1的表达与肿瘤分级和淋巴结转移有关（P<0.05）；多因素logistic回归分析结果显示：EZH2及DNMT1表达与肿瘤组织学分级有关（p<0.01）,随着组织分级升高,EZH2及DNMT1表达也升高。结论EZH2及DNMT1蛋白均参与了TNBC的进展及转移,联合检测二者的表达可能对TNBC的预后判断具有潜在的价值。目的检测TNBC组织中抑癌基因14-3-3sigma、RASSF1A、CDH1、P16、 ERa启动子甲基化状态。分析它们与三阴性乳腺癌临床病理参数的关系,从而探讨抑癌基因甲基化在TNBC中的临床意义。方法运用甲基化特异性PCR （methylation-specific polymerase chain reaction, MSP）分别对119例TNBC组织和58例癌旁组织P16、CDH11、RASSF1A、 14-3-3 sigma、ER3、ER4、ER5启动子区甲基化状况进行检测。结果14-3-3sigma基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为71.4%、29.3%（P<0.05）;RASSFIA基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为42.1%、19.1%（P<0.05）；CDH1基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为37.8%、16.1%（P<0.05）；P16基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为40.3%、23.5%（P<0.05）; ERa基因在TNBC和癌旁组织中的甲基化发生率分别为78.2%、41.4%（P<0.05）。14-3-3 sigma基因甲基化与组织学分级、肿瘤类型、淋巴结转移相关,浸润性导管癌中14-3-3 sigma基因甲基化率明显高于其他组织类型,G3组14-3-3sigma基因甲基化率高于G1、G2组,淋巴结转移组14-3-3sigma基因甲基化率高于未发生淋巴结转移组,组间差异具有统计学意义（P<0.05）；RASSF1A基因甲基化与肿瘤组织学分级相关,G3组RASSF1A基因甲基化率高于G1、G2组,（P<0.05）; CDH1基因甲基化与肿瘤类型、淋巴结转移有关,浸润性导管癌中CDH1基因甲基率高于其他肿瘤类型,淋巴结转移组CDH1基因甲基化率高于未发生淋巴结转移组,组间差异具有统计学意（P<0.05）；P16基因甲基化仅与淋巴结转移相关,淋巴结转移组P16基因甲基化率高于未发生淋巴结转移组,组间差异具有统计学意义（P<0.05）; ERa基因甲基化与肿瘤直径和肿瘤类型相关,肿瘤直径>2cm组ERa基因甲基化率高于直径<2Cmm组,浸润性导管癌中ERa基因甲基化率高于其他肿瘤类型组,组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结论14-3-3sigma、RASSF1A、CDH1、P16、ERa 5种抑癌基因甲基化发生率均显著高于癌旁正常组织,提示5种抑癌基因甲基化与三阴性乳腺癌关系密切；其中14-3-3sigma、CDH1、P16基因高甲基化与乳腺癌淋巴结转移有关；且RASSFIA基因甲基化与组织学分级密切相关。ERα分别于组织学分级和肿瘤类型相关。抑癌基因甲基化是TNBC高频事件,可能也是TNBC发生的原因之一,因此联合检测TNBC中多抑癌基因甲基化可能,有助于为TNBC的诊断筛选新方法。目的分析EZH2及DNMT1的表达与抑癌基因14-3-3sigma、RASSF1A、 CDH1、P16、ERα、启动子甲基化状态间的相关关系,进一步揭示影响抑癌基因甲基化的因素,为三阴性乳腺癌的诊断及治疗提供理论基础。方法具体实验材料及操作方法见第一章、第二章资料与方法部分。所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行分析。χ2检验分析三阴性乳腺癌中EZH2及DNMT1的表达与抑癌基因甲基化状态之间的关系,P<0.05为差异有统计学意义。结果三阴性乳腺癌病例中14-3-3sigma、P16、ERα三个基因的甲基化率在EZH2阳性表达组中均高于阴性表达组,差异有统计学意义,（P<0.05）。14-3-3sigma基因甲基化率在DNMT1阳性表达组中高于阴性表达组,差异有统计学意义,（P=0.036）。结论三阴性乳腺癌中EZH2及DNMT1的表达均与14-3-3sigma基因甲基化相关；其中EZH2的表达还可影响P16、ERα发生甲基化。EZH2和DNMT1协同表达可能是影响三阴性乳腺癌中抑癌基因甲基化的早期事件之一。