阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病,临床.表现为认知和记忆功能不断恶化,日常生活能力进行性减退,并有各种神经精神症状和行为障碍。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。阿尔茨海默病是最常见的痴呆原因。阿尔茨海默病和其他神经退化性疾病一样,本质上是多因素性的复杂疾病。发病原因尚不明确,已知涉及的风险因素包括年龄、性别、家族遗传、受教育程度、吸烟、抑郁、心理压力、病毒感染以及头部外伤等诸多因素。阿尔茨海默病的发展与人衰老的过程相关。随着年龄的增长,神经元死亡和突触功能丧失增多,阿尔茨海默病患病率随着年龄增长而升高。阿尔茨海默病的神经病理核心特征是β淀粉样肽沉积构成细胞外老年癍和细胞内由超磷酸化tau蛋白组成的神经元纤维缠结聚集。老年癍和神经纤维缠结二者都与由脑组织减少引起的神经元、突触丧失、大脑萎缩、侧脑室扩张关系密切。阿尔茨海默病患者的大脑中有严重的神经元丢失,并伴随部分脑皮质的萎缩。皮层神经元萎缩,突触的损失和神经元树突萎缩可能是阿尔茨海默病的关键病理基础。阿尔茨海默病的发病机制尚不明确,目前有多种学说解释其分子机制,如分子遗传和基因学说、炎症学说、氧化应激学说、自由基学学说、病毒学说等。从基因的表达入手,分析阿尔茨海默病的分子病理基础是探究该病的发病机制、诊断、预防和治疗方法的有效手段。以往利用基因工程技术等手段在阿尔茨海默病的研究上取得了重要的丰硕成果。基因芯片技术的出现克服了以往单基因研究的局限性,可以从整体的角度把握和理解阿尔茨海默症的发生发展。近年来的研究证实了基因芯片技术在阿尔茨海默症方面研究的有效性和重要性。生物信息学是随着基因组数据剧增而发展起来的交叉学科,用于对核酸、蛋白质等方面的生物学数据进行收集、储存、管理、注释、分析、挖掘。生物信息学已广泛用于生命科学各个领域,成为生命科学研究的一个重要手段,在研究人类基因的识别与功能、蛋白质的结构与功能等方面发挥着关键作用。特别是近些年来,生物信息学利用公共数据库中的海量数据在研究人类疾病基因及相关机制、基因表达调控、药物筛选及靶标以及提出和验证生物学假说等方面起到了不可替代的作用。生物信息学的发展,也为进一步研究AD带来新的契机。近年来,生物信息学已被快速广泛地用于AD相关基因的识别、不同阶段的差异表达分析、AD患者大脑不同区域的转录组分析、AD与衰老和年龄的关联分析以及AD与性别的关系分析等。生物信息学在AD上的应用使人们对AD发生发展的分子机制有了更为深刻的认识。由于生命系统的复杂性,生物的表型与基因型并不是单一的对应关系,二者之间的复杂关系无法由某单个基因的变化来解释。细胞中是成千上万种蛋白通过有组织的参与信号传导、代谢等通路才能够完成生理活动过程的,而这个过程涉及的具体功能又需要功能相关的多种蛋白参与。一个功能性基因系统由协同和相互依赖的分子模块组成。在神经细胞生理和病理过程中,细胞功能的变化常常涉及多个基因模块或蛋白质模块的变化,而组成基因模块的基因往往参与相同的生物过程或具有相似的生物功能,特别是履行相关功能的基因常常会出现共调控和共表达现象。研究脑组织神经细胞中基因间的共表达和共调控关系以及这些关系在正常脑组织和阿尔茨海默患者脑组织中的改变有助于更好的探索和理解阿尔茨海默病的分子机制。为了深入理解阿尔茨海默病的分子机制,本研究把GEO中阿尔茨海默病相关数据集作为分析材料,综合运用多种生物信息学方法从多层次多角度探讨了阿尔茨海默病的基因变化。首先从总体上分析了正常对照组和AD组样本在大脑各组织部位的表达情况,然后识别阿尔茨海默症和正常脑组织样本的共表达模块并分析了这些模块的功能,进一步研究了两组共表达模块功能的相似性以及各相似性模块在两组样本中各组织部位的表达模式,识别了与年龄显著相关的基因子模块,以及它们在正常组和阿尔茨海默组中各组织中的表达模式,最后研究了各组织年龄相关基因子模块基因的调控以及阿尔茨海默症内嗅皮质样本中年龄相关基因的蛋白质互作关系。本研究分为四个部分:第一部分:阿尔茨海默病相关基因芯片数据集的处理和表达分析首先从由美国国立生物技术信息中心National Center for Biotechnology Information,NCBI)创建并维护的GEO数据库中下载阿尔茨海默病相关数据集GSE48350原始数据。然后运用R/Bioconductor软件包对数据集进行背景校正、归一化、对数化处理,并对预处理后的数据进行过滤和注释。接着采用自组织映射(SOM)的方法分析GSE48350数据集中所有处理后获得的基因在正常对照组和AD组样本中的整体表达分布以及脑部各个区域的表达差异。通过自组织映射分析发现,在正常对照组中与阿尔茨海默病组样本中,基因的表达差异很大,而且,在同一组中大脑不同部位的组织中基因的表达模式也不一致。这些发现充分说明大脑组织基因表达和阿尔茨海默病分子机制的复杂性。第二部分:脑组织共表达基因模块的识别和功能分析首先,对前面已经过处理的基因芯片数据,采用一种无监督学习的“吸引子”算法分别从正常对照组和阿尔茨海默组识别共表达基因模块。经过多次迭代运算,最终在正常对照组得到3个共表达基因模块,阿尔茨海默组得到5个共表达基因模块。在设定的阈值范围内,正常对照组的第一个共表达模块中的基因有513个,第二个共表达模块有1771个,第三个共表达模块有205个;阿尔茨海默组中5个共表达模块分别包含327、1467、246、43和21个基因。在识别吸引子过程中,发现在正常对照组和阿尔茨海默组的共表达模块中各有一对模块的元基因相互呈高度负相关关系。采用吸引子算法获得的各基因共表达模块内的基因成员呈高度共表达关系,这些基因构成的模块可能在功能上是高度相关或协同的,共同参与细胞生理过程。为了获得各共表达模块内基因的功能,把各模块内的基因利用DAVID生物信息学工具进行了功能分析。功能分析表明,这些模块与神经系统功能密切相关,其动态可能反映了神经系统功能变化。第三部分:功能相似性模块的识别及其在正常和阿尔茨海默病各组织样本中的表达模式分析首先对两组中的各个模块进行两两比较,计算模块之间的功能相似性,根据相似性的大小确定两组中功能对应的模块。根据相似性计算,阿尔茨海默组的第一个模块和正常对照组的第一个模块的功能相似性为0.684、阿尔茨海默组的第二个模块与正常对照组的第二个模块的相似性为0.567,阿尔茨海默组第三个模块与正常对照组的第三个模块的相似性为0.51,高于这些组与其他模块的相似性,因此,阿尔茨海默组的第一、第二和第三个模块分别对应于正常对照组的第一个模块、第二个模块和第三个模块。对通过上述计算获得的功能相似的模块,提取它们共同的基因,两组样本中第一个模块重叠的基因有255个,第二个模块重叠的基因有1057个,第三个模块重叠的基因有202个。两组中第一对相似模块的共同参与的功能主要为蛋白质结合、生物调控、细胞过程的调控和细胞过程的负调控等。第二对相似模块中具有绝大多数相同的基因,共同涉及的功能主要有突触、突触传导、神经元映射、线粒体、神经脉冲的传递、离子转运、蛋白质结合等,共同参与的信号通路有氧化磷酸化、亨廷顿病、钙信号通路、阿尔茨海默信号通路、轴突导向以及帕金森病信号通路等。第二对相似模块中的大部分基因具有典型的神经系统特征。然后分析功能相似模块中的基因在60岁以上正常对照组和阿尔茨海默组各脑组织中的表达模式。对各相似模块中提取的共同基因,应用多项式回归方法对年龄进行回归分析,根据统计学显著性(p<0.05)和调整的R2进行筛选,获得模块中年龄相关基因。分析结果显示,三个模块中年龄相关基因在各组织中分布差异很大,说明各组织中的基因对年龄或衰老的敏感性不一样。与正常对照组相比,在阿尔茨海默组的相同组织中,基因的分布也具有很大差异,仅从数量上看,阿尔茨海默病对各组织中的基因表达均有影响。另外,从两组中相同组织基因的变化数目看,两组中基因数目变化最大的是在中央后回和海马体组织,中央后回和海马体组织在正常组中发现较多年龄相关基因,而在阿尔茨海默组则只有极少数年龄相关基因被发现。阿尔茨海默组的内嗅皮质中存在较多的年龄相关基因。可见,不同模块中的基因在不同的脑组织中受到的影响不同,在两组间,这些基因数量和表达的变化影响到大脑的功能,可能直接或间接与阿尔茨海默病相关。在正常海马体组织,在第一个模块中的年龄相关基因与年龄呈非线性关系,这些基因的表达水平随着年龄的增长而下调,而第二个模块中,年龄相关基因的表达则是随年龄增长呈现上调趋势,并发现突触相关基因与线粒体相关基因表达趋势一致,说明神经系统功能与线粒体之间具有密切的关系。两个基因模块在正常海马体组织中的年龄相关基因的表达趋势正好相反。由此看出,这两模块中年龄相关基因的表达在两组织中成负相关关系。在正常中央后回组织,模块A中年龄相关基因的表达水平随年龄增长而上升,模块B中年龄相关基因则与年龄呈现负相关关系。它们的表达模式均为非线性。在阿尔茨海默症内嗅皮质样本中,两个模块中的年龄相关基因的表达水平与年龄呈线性关系,而且二者趋势相反。通过分析发现,在正常对照组中,中央后回和海马体组织中年龄相关基因数量最多,说明这两组织的功能变化最容易体现大脑的衰老过程。然而,研究发现,由于受阿尔茨海默症病变的影响,年龄相关基因数量变化最大的也是这两个组织。这说明阿尔茨海默症中,这两个组织功能受损最为严重。年龄相关基因的表达模式在阿尔茨海默病和正常组海马体、中央后回组织中的变化反映了这两组织的正常衰老过程受到阿尔茨海默病变的干扰或破坏。第四部分:海马体组织、中央后回组织中年龄相关基因模块的调控网络研究及内嗅皮质组织中年龄相关基因的蛋白质互作网络分析为了比较正常和阿尔茨海默症海马体和中央后回组织中可能存在的调控关系变化,利用LICORN学习算法分别在正常和阿尔茨海默症的海马体组织和中央后回组织对年龄相关基因推断了调控网络,识别了这些基因中的转录调控子以及它们与其他基因潜在的调控关系,并构建了这些转录调控子之间的共调控关系。通过对两样本组的转录调控子和共调控网络进行比较,发现阿尔茨海默症样本中转录调控子之间的共调控关系发生了变化。这些变化可能与阿尔茨海默症的病理过程相关。同时,还发现了 TFEB、TCF12、PTMA三个转录调控子在两组织中具有保守性。对阿尔茨海默症内嗅皮质样本中年龄相关基因构建了蛋白质相关作用网络,并进行了网络分析,获得了 11个关键基因。这些基因的动态变化可能反映了阿尔茨海默症的进展和严重程度,少数关键基因有希望成为阿尔茨海默症的治疗靶标。