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肝细胞肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率居第二位；而肝癌的手术切除复发率高，放疗和化疗敏感性低，免疫疗法和介入治疗效果均不理想。随着分子生物学的发展，肿瘤的基因协同药物治疗在不久的将来必将成为理想的治疗手段。 1，25-（OH）2D3是维生素D3的活性形式，通过特异受体介导并通过维生素D受体之间的相互作用来调节基因的表达。1，25-（OH）2D3的生物学活性除了能调节体内的钙磷平衡和维持内环境的相对稳定外，对细胞的增生和分化有一定的调节作用，如临床上用维生素D可以长期治疗银屑病，并有很好的疗效。但它同时也可引起机体的高钙血症，这一副作用严重影响了它的临床应用。EB1089是维生素D3的类似物，通过维生素D受体的介导，有很强的抗乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤细胞增殖的活性，可以诱导多种肿瘤细胞的凋亡。虽不能完全避免高钙血症的发生，但较1，25（OH）2D3约低50％，因此EB1089是一种被广泛研究的维生素D类似物。细胞周期主要是由细胞周期蛋白（cyclin），细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）和CDK抑制蛋白（CDKI）来调控的。p27KiPl是近年来发现的一个cip/kip家族新的CDK抑制蛋白，它主要通过抑制cyclin/E/CDK2、cyclinD/CDK4、CDK6复合物的激酶活性而在G1期、G1-S期抑制细胞周期的传递，也可通 束四军医大学俗士掌位论又·中文扫丘 过抑制CyClinB及其激酶活性对GZ－M期产生抑制作用。该基因过度表达对 靶细胞可产生细胞毒性。p27“lP‘作为 CDKI的一员，可以抑制细胞增殖、 促进凋亡、诱导分化、可作为肿瘤恶性程度的标志物等，是一种潜在的抑 癌基因，其抗癌机制的研究为鉴别诊断，判断预后，基因治疗等提供一定 的依据，已成为生物医学领域的重要课题。 本研究旨在探讨： 门)p27h…基因和 VDR受体与肝细胞肝癌发生发展的关系 门)EB1089和过表达的p27“‘”基因抑制肝癌细胞的可能机制 门)EB1089对p27“‘’‘蛋白表达的调节作用及其可能的机制 实验方法 （l）原位杂交和免疫组织化学染色方法检测肝硬化、癌旁和肝癌组织中 p27K‘”InRNA及其蛋白的表达；RTPCR方法检测肝癌组织中VDR的表达。 （2）利用脂质体介导法将p27＊…基因导入HCC习204细胞中，用Western him检测 p27Ki”是否导入到肝癌细胞中；用 MTT、平板克隆形成实验、软 琼脂克隆形成实验检坝 l，25－（OH）。D；、EB1089和过表达的 p27卜”’对肝癌 细胞HCC．9204的抑制作用；以裸鼠为材料制成肝癌动物模型，通过计算 药物裸鼠移植瘤的抑制率，了解在体内 EB1089和过表达的 p27h”对肝癌 的抑制作用；应用流式细胞仪、电子显微镜技术、TRAP干CR－ELISA和 TMP．PAGE方法探讨 EB 089和过表达的 p27h’‘抑制肝癌细胞生长的可 能机制。 （）RT干CR和Western七lot方法检测EB1089对p27“”’表达的调节作用 及其可能的机制。 实验结果 门)应用原位杂交方法检测了 69例组织标本中 p27h…InRNA的表达， 发现 p27K’P’InRNA主要定位于胞浆，呈颗粒状散在分布，在肝硬化、癌旁、 －4． 第四军医大学博士学位论文·中文茵县 各级HCC组织中的阳性表达率和阳性细胞指数比较相似，在统计学上无显 著性差异J叩．0引。用免疫组织化学染色方法检测社7“‘’‘蛋白在各组织 标本中的表达，发现 p27“i”蛋白定位于胞浆／胞核，在癌旁肝组织和肝硬化 组织中的表达率及阳性细胞指数均明显高于＊＊C组织（P＜0．05）。＊＊C组 织中 p27KIP’蛋白的阳性细胞指数与 HCC细胞的分化程度呈正相关。 （2）应用 RT－PCR方法检测了 9例肝癌组织中 VDR mANA的表达水平， 结果显示肝癌组织中VDXITIRNA的表达水平与肝癌组织分级之间没有相 关关系。 （3）10～1000nmol／LI，25（OH）卫D。和 1100 nmoll EB1089均对肝癌细胞 ＊＊O9204有明显的抑制作用，且呈剂量效应关系：而且＊BI 089对肝癌细 胞生长的抑制作用明显强于 1，25(OHhD3，是它的 10倍。体内实验也表明 EB 089对裸鼠移植瘤有明显的抑制作用，其抑制率为 35刀5％。通过脂质 体介导法将真核表达载体pc＊＊＊3刁／M y仁H以幻C巾仆‘…转染入＊＊Cgm4 细胞，了解过表达的 p27Ki”对肝癌细胞 HCC习204的抑制作用；结果在体 外、体内的实验均表明过表达的p27＊”对HC