论文部分内容阅读
目的通过2型糖尿病大鼠模型,研究糖尿病肾病发展过程中氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)对肾脏功能以及肾脏纤维化的影响,观察糖尿病肾病过程中肠道菌群变化,分析肠道菌群的功能;通过粪菌移植验证糖尿病肾病大鼠肠道菌群TMAO生成能力变化;通过肾小球系膜细胞(Human mesangial cells,HMC)与肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)验证TMAO对细胞的促炎作用,并进一步检测TMAO对炎性反应信号通路MAPK/NF-κB的影响。方法(1)通过糖尿病肥胖大鼠(Zucker Diabetic Fatty,ZDF)喂养粗蛋白和粗脂肪的Purina#5008饲料建立大鼠糖尿病肾病模型,随机分成4组:空白对照组(C1组:ZDF对照大鼠组)、糖尿病肾病模型组(E1组:ZDF大鼠糖尿病模型组)、空白抑制剂组(C2组:ZDF对照大鼠+DMB)、糖尿病肾病抑制组(E2组:ZDF大鼠糖尿病模型+DMB),3,3-二甲基-1-丁醇(3,3-dimethyl-1-butanol,DMB)是胆碱的结构相似物,可以减少TMAO的生成。在造模8周糖尿病肾病模型建立时取肾脏、血液、粪便进行检测。(2)对血液标本进行肾功能检测,通过高效液相色谱串联质谱法检测血清TMAO含量;HE染色和Masson染色观察大鼠肾脏组织形态变化以及肾脏纤维化并通过蛋白免疫印迹技术对大鼠肾脏组织纤维化相关蛋白P-samd3进行检测。(3)对四组的大鼠粪便通过16SrRNA测序进行检测并通过粪便菌群移植对菌群功能进行研究。(4)通过TMAO和NF-κB抑制剂对HMC与HK-2细胞进行处理,CCK-8法检测细胞生存率;实时荧光定量PCR对炎性反应因子IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1进行检测,蛋白免疫印迹法检测p65蛋白、P-p65、细胞核与细胞质P65、ERK、P-ERK蛋白表达进行检测。结果(1)造模8周时,模型组(E1,E2组)大鼠血糖超过16.7 mmol/L,与对照组(C1,C2组)相比肾功能指标β2微球蛋白、胱氨酸蛋白酶抑制剂C、尿酸和肌酐含量升高(P<0.05),HE染色显示明显肾脏组织结构损伤,因此糖尿病肾病模型建立成功。(2)ZDF糖尿病肾病模型组相比于糖尿病肾病抑制组肾脏HE染色显示出明显的肾小球结构损伤,肾功能指标β2微球蛋白、胱氨酸蛋白酶抑制剂C、尿酸和肌酐含量升高的上升(P<0.05),Masson结果显示肾脏明显发生纤维化,并且纤维化P-smad3蛋白的表达量升高(P<0.05);非抑制组(C1,E1组)与抑制组相比(C2,E2组)血清TMAO含量升高(P<0.05)。(3)大鼠肠道菌群测序结果显示,在糖尿病肾病过程中肠道菌群菌群多样性发生改变,并且以肠道菌群作为生物标志物区分糖尿病肾病模型组与对照组时ROC曲线下面积可达到0.83。粪菌移植结果显示糖尿病肾病模型组相较于对照组菌群产TMAO能力更强(P<0.05)。(4)TMAO处理后HMC与HK-2细胞相较于对照组炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA表达上升(P<0.05);蛋白免疫印迹结果显示MAPK通路中的P-ERK与NF-κB通路上的P-p65蛋白表达升高(P<0.05),并且TMAO处理后细胞核p65蛋白表达升高(P<0.05);TMAO与NF-κB信号通路抑制剂联合处理后相较于TMAO单独处理的细胞炎性反应因子降低(P<0.05)。结论(1)在糖尿病肾病的进程中肠道菌群结构会发生明显的变化,菌群生成TMAO能力增强,引起血清TMAO的升高,进一步引起肾脏损伤与纤维化程度的加重。(2)TMAO可以激活MAPK/NF-κB信号通路进一步产生炎性细胞因子。