第一部分IL-8和整合素αvβ3在肝细胞癌侵袭中的作用机制研究背景:肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)位居癌症相关死亡第四位,其发病隐匿,早期症状不明显,多数病例在发现时已处于晚期,错过了最佳治疗时机,往往预后较差。随着对HCC发病机制的深入研究和分子靶向药物的发展,以索拉菲尼为代表的分子靶向治疗取得了令人鼓舞的成绩,丰富了治疗手段,也给我们研究HCC提供了新的思路。但是,HCC仍然是全球癌症相关死亡较高的疾病之一,严重威胁着人类的健康。究其原因主要是HCC恶性程度高,容易发生血管侵犯和肝内外转移。肿瘤的侵袭转移是一个复杂的、多步骤的动态过程,在每一步都有肿瘤微环境中的多种细胞和分子与肿瘤细胞发生作用,各种肿瘤转移相关基因和分子的激活以及肿瘤血管的形成在整个过程中协同作用,最终完成肿瘤的扩散。因此,加强对肿瘤侵袭转移的分子机制研究,寻找潜在的分子靶点,开发针对靶点的药物,将有助于攻克癌症。在肿瘤微环境中,细胞之间的相互作用离不开细胞因子的介导,其中就包括IL-8。IL-8于1987年作为白细胞趋化因子被发现,因而又称趋化因子CXCL8,是ELR+-CXC亚家族的一员。IL-8在生理状态下几乎检测不到,但在病理状态下,可以由炎性细胞和肿瘤细胞等多种细胞分泌。IL-8有两个G蛋白偶联受体,CXCR1和CXCR2,广泛分布于炎性细胞、肿瘤细胞以及肿瘤相关基质细胞的细胞膜上。IL-8通过与CXCR1/2结合,激活PI3K、MAPK等不同的下游信号通路,从而介导不同的生物学行为;不仅广泛参与炎症性疾病,还在乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色,能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、耐药和肿瘤血管生成等。IL-8在HCC组织中高表达与肝内外转移、术后复发及不良预后密切相关;进一步研究发现IL-8能够诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化(EMT),促进肝癌细胞迁移和侵袭。此外,血清IL-8升高对HCC的诊断和预后判断有参考价值。整合素家族是一种异源二聚体细胞表面受体家族,目前已报道18个α亚基、8个β亚基,能形成至少24个异源二聚体受体。整合素对细胞和细胞外基质的粘附起介导作用,它们通过与配体特异性或非特异性结合,在细胞内外形成物理连接来感知细胞周围环境变化并触发一系列细胞反应,从而允许双向的“整合”信号来控制细胞的粘附、迁移、增殖、存活和分化;不仅参与正常生理发育过程,还在肿瘤的进展过程中发挥重要作用。整合素αvβ3是该家族的一员,在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌及黑色素瘤等多种肿瘤中表达,在转移灶中尤为明显;它能广泛地与细胞外基质分子非特异性结合,在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和肿瘤血管生成中起着至关重要的作用,与疾病的进展和预后密切相关。此外,整合素αvβ3还在肝癌组织中高表达,介导肝癌细胞的侵袭转移和耐药等。通过回顾文献,我们发现IL-8和整合素αvβ3均在HCC组织中高表达,并都在HCC侵袭转移过程中发挥重要作用。而且,目前已有多篇文献报道IL-8通过上调整合素表达促进肿瘤的侵袭转移,但IL-8和整合素αvβ3是否协同参与HCC侵袭转移过程尚不清楚,有待进一步研究。目的:1.明确IL-8与整合素αvβ3在肝细胞癌中的表达情况,探索两者是否存在相关性及其与临床病理因素之间的关系;2.探索IL-8和整合素αvβ3在肝细胞癌侵袭中的作用机制。方法:1.利用免疫组化检测170例肝癌组织[含135例普通肝细胞癌和35例肉瘤样肝细胞癌(肿瘤细胞呈梭形,是一种EMT表型的高侵袭性HCC亚型)]以及其中配对的56例癌旁组织中IL-8、整合素αvβ3表达情况,分别比较不同肝癌亚型中、配对的癌与癌旁组织中两者的表达水平;采用Spearman等级相关检验探讨IL-8和整合素αvβ3表达之间的相关性;分析IL-8和整合素αvβ3表达与各临床病理因素之间的关系。2.利用实时荧光定量PCR和Western blot检测4个具有不同转移潜能的肝癌细胞(HCCLM3、MHCC97H、Huh7和HepG2)中IL-8、整合素αv和整合素β3的mRNA水平和蛋白表达水平。3.利用IL-8 siRNA和外源性IL-8分别处理肝癌细胞,CCK8检测IL-8对肝癌细胞增殖的影响,Transwell实验检测IL-8对肝癌细胞侵袭的影响。4.利用IL-8 siRNA和外源性IL-8分别处理肝癌细胞,再利用荧光定量PCR和Westernblot分别检测整合素αvβ3的mRNA水平和蛋白表达,研究IL-8对整合素αv亚基、β3亚基表达的影响;并利用整合素β3 siRNA和过表达质粒反向验证,以明确IL-8是否通过调节整合素β3表达从而影响肝癌细胞的侵袭能力。5.利用CXCR1/2 siRNA分别转染肝癌细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测整合素β3的mRNA和蛋白表达,Transwell实验检测肝癌细胞侵袭能力,研究CXCR1/2在IL-8介导的整合素β3表达和肝癌细胞侵袭中的作用。6.利用IL-8 siRNA、外源性IL-8以及PI3K特异性抑制剂LY294002处理肝癌细胞,Western blot检测整合素β3表达、PI3K/Akt的表达和磷酸化,Transwell实验检测肝癌细胞侵袭能力,研究PI3K/Akt信号通路在IL-8介导的整合素β3表达和肝癌细胞侵袭中的作用。结果:1.在170例肝癌组织中,IL-8中位(Q1,Q3)IHC评分为4(2,5)分,肉瘤样HCC比普通HCC的IHC评分有增高趋势,但无显著差异(p=0.137),IL-8高表达89例(52.4%),其中普通HCC 69例,肉瘤样HCC 20例,两种病理亚型的高表达率无明显差异(51.1%vs 57.1%,p=0.524);通过对56例配对肝癌与癌旁组织的IHC评分分析发现,IL-8在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织(p<0.001);IL-8高表达与肝癌的血管胆管癌栓、AJCC分期相关(all p<0.05),与周围脏器侵犯有相关趋势(p=0.062)。170例肝癌组织中,整合素αvβ3中位(Q1,Q3)IHC评分为3(1,4)分,肉瘤样HCC比普通HCC的IHC评分有增高趋势,但无显著差异(p=0.100),整合素αvβ3高表达72例(42.4%),其中普通HCC 55例,肉瘤样HCC 17例,两种病理亚型的高表达率无明显差异(40.7%vs 48.6%,p=0.403);整合素αvβ3在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织(p<0.001);整合素αvβ3高表达与肝癌的血管胆管癌栓相关(p=0.03),与AJCC分期有相关趋势(p=0.084)。采用Spearman等级相关检验分析发现IL-8和整合素αvβ3在肝癌组织中表达显著相关(R=0.24,p=0.0014)。而且,IL-8和整合素αvβ3的高表达组合与肝癌的血管胆管癌栓、周围脏器侵犯、AJCC分期以及组织分化程度相关(all p<0.05),与淋巴结转移有相关趋势(p=0.062)。2.高转移潜能肝癌细胞(HCCLM3和MHCC97H)中IL-8、整合素αv和整合素β3的mRNA水平和蛋白表达明显高于低转移潜能肝癌细胞(Huh7和HepG2)。3.下调内源性IL-8表达及利用外源性IL-8孵育肝癌细胞,均对肝癌细胞的增殖能力无明显影响;下调内源性IL-8表达降低肝癌细胞侵袭迁移能力;外源性IL-8呈浓度依赖性上调肝癌细胞侵袭能力。4.下调内源性IL-8表达降低整合素β3表达,对整合素αv表达无明显影响;外源性IL-8呈浓度依赖性上调整合素β3表达,对整合素αv表达无明显影响。上调整合素β3表达逆转IL-8 siRNA对肝癌细胞侵袭能力的抑制作用;下调整合素β3表达抑制外源性IL-8诱导的肝癌细胞侵袭。5.下调CXCR1/2表达明显降低IL-8诱导的整合素β3表达和肝癌细胞侵袭能力。6.下调内源性IL-8表达对PI3K、Akt的总蛋白表达无明显影响,但能降低PI3K和Akt的磷酸化水平;外源性IL-8对PI3K、Akt的总蛋白表达无明显影响,但能提高PI3K、Akt的磷酸化水平以及肝癌细胞侵袭能力;PI3K抑制剂能明显抑制外源性IL-8诱导的整合素β3表达上调和肝癌细胞侵袭。结论:1.IL-8和整合素αvβ3均在肝癌组织中表达升高,两者在肝癌中表达显著正相关;而且IL-8与整合素αvβ3高表达组合与肝癌的血管胆管癌栓、周围脏器侵犯、AJCC分期以及组织分化程度正相关,与淋巴结转移有正相关趋势。2.IL-8通过上调整合素β3的表达促进肝癌细胞侵袭,CXCR1/2和PI3K/Akt通路均参与了这一过程,IL-8/CXCR1/CXCR2/PI3K/Akt/Integrin β3信号轴是肝细胞癌的潜在治疗靶点。第二部分肉瘤样肝细胞癌的临床病理特征及预后研究研究背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常见的病理形态呈小梁状结构,即由形态类似肝细胞的肿瘤细胞呈条索状排列,被血窦样腔隙分隔,形似小梁而得名。此外,HCC还有一些特殊病理亚型,如肉瘤样肝细胞癌、纤维板层型肝细胞癌、硬化型肝细胞癌等,他们不仅在细胞形态和组织结构上与普通HCC不同,其发病机制、基因突变谱和预后也存在差异。但是,由于比较少见,人们对于这些特殊病理亚型的认识有限,目前的指南也缺乏针对这些HCC亚型的诊疗建议。在精准治疗时代,深入研究这些病理亚型的临床特征、治疗、预后以及分子机制,将HCC患者按照病理亚型甚至分子分型进行分类管理,采取个体化的诊疗策略,将会有更多的患者从中获益。肉瘤样肝细胞癌(sarcomatoid HCC)是一种高侵袭性病理亚型,常侵犯周围脏器和转移,容易早期复发,通常预后极差。该亚型约占HCC手术切除病例的2%,占HCC尸检病例的3.9%～9.4%,发病率较低;但由于HCC发病人数众多,而且全球超过一半的HCC都发生在我国,该亚型的HCC患者总数量并不少。目前,关于肉瘤样HCC的文献报道不多,并且以个案报道为主。因此,加深对肉瘤样HCC的研究,有着重要的现实意义。肉瘤样HCC是由不同比例的癌性成分和肉瘤样成分组成(部分病例只有肉瘤样成分);其肉瘤样成分一般由呈席纹状排列的梭形细胞组成,形态类似肉瘤,但又不同于真正的肉瘤,关键区别在于肉瘤样成分仍具有某些上皮细胞的特点,如上皮标志物、桥粒等;其癌性成分通常由分化差[Edmondson-Steiner(ES)gradeⅢ/Ⅳ]的普通肝癌细胞构成。目前,包括肉瘤样HCC在内的肉瘤样癌的组织学发生机制尚不明确,存在多种假说,其中最广为接受的是转化学说,即认为在肿瘤发展过程中,癌性组织在某些作用机制下转变为肉瘤样组织,近年来,研究表明上皮-间质转化是肉瘤样改变的重要机制,进一步印证了转化学说。既往报道通常选择普通HCC作为对照组来研究肉瘤样HCC,结果表明肉瘤样HCC恶性程度更高、预后更差。但肉瘤样HCC 比普通HCC组织分化程度低,其癌性成分通常呈低分化(ES Ⅲ-Ⅳ级);而组织分化程度是重要的预后影响因素,通常分化越差,预后越差。但是,此前的研究并没有考虑到组织分化程度对肿瘤特征和预后的影响,没有将普通HCC进一步分层为低级别(ESⅠ-Ⅱ级)和高级别(ESⅢ-Ⅳ级)HCC。此外,肉瘤样HCC是由癌性和肉瘤样两种成分构成,究竟是哪种成分对肿瘤的侵袭性占主导地位呢?迄今为止,只有一篇文献对此做了研究,结果表明肉瘤样HCC的血管癌栓和转移灶以肉瘤样成分居多,据此推测肉瘤样成分占据主导地位。但该研究仅纳入了 13例肉瘤样HCC,其中5例还接受过术前TACE等抗肿瘤治疗,并且包含了一例术后广泛转移的尸检病例,而该病例的转移灶全都是由肉瘤样成分组成;因而该研究结果可能存在偏倚。鉴于既往研究的不足,我们将对肉瘤样HCC做进一步的研究。目的:研究肉瘤样HCC的临床病理特征和预后;分析肉瘤样HCC病例的癌栓、淋巴结和肝内病灶的组织学成分,深入探讨该亚型的组织学发生机制。方法:回顾2007年1月至2017年12月期间,在山东大学附属省立医院肝胆外科接受手术治疗的肝癌患者资料,最终筛选出41例肉瘤样HCC和155例高级别HCC。随后,我们采用标准化表格收集患者的临床特征、肿瘤特征、实验室基线资料以及生存资料等;并采用Mann-Whitney U检验比较两组间的数值型资料,Pearson卡方检验或双尾Fisher精确检验比较两组间的分类资料,利用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验比较两组间的总生存(overallsurvival,OS)和无复发生存(recurrence-free survival,RFS),利用Cox比例风险回归模型分析肉瘤样HCC这一病理亚型是否HCC患者的独立预后影响因素。此外,还由两名影像科医师分析肿瘤影像学特征,由两名病理医师分析肉瘤样HCC病例的癌栓、淋巴结和肝内病灶的组织学成分。结果:1.两组患者在发病年龄、性别构成、饮酒、病毒感染、肝硬化、Child-Pugh分级、血肌酐、谷丙转氨酶、总胆红素、国际标准化比值(INR)、BCLC分期、肿瘤部位、肿瘤个数、血管癌栓、MVI、卫星灶、自发性破裂、复发模式等方面均无统计学差异(all p>0.05)。肉瘤样HCC组比高级别HCC组术后复发率更高(82.9%vs 69.7%),但两者之间无显著统计学差异(p=0.091)。相较于高级别HCC,肉瘤样HCC患者就诊时伴有非特异性症状的比例更高(78%vs55.8%,p=0.009),肿瘤直径更大(8.6cmvs5.5cm,p=0.007),出现肿瘤坏死、肿瘤包膜缺失、周围脏器侵犯、淋巴结转移的发生率更高以及更晚的AJCC分期(allp<0.05)。此外,肉瘤样HCC组的血清AFP水平明显低于高级别HCC组(5.8 vs 348.0ng/ml,p<0.001);具有典型“快进快出”影像特征的患者比例也明显低于高级别 HCC 组(44.4%vs 72.7%,p=0.001)。2.Kaplan-Meier生存曲线显示肉瘤样HCC组的中位OS明显短于高级别HCC组(10.5vs48.1月,p<0.0001),两组间的第1年、第3年、第5年总生存率分别对比如下:48.8%vs85.2%、17.3%vs53.4%、11.5%vs 41.1%;肉瘤样 HCC组的中位RFS也明显短于高级别HCC组(5.6 vs 16.4月,p<0.0001),两组间的第6月、第1年、第3年术后无复发生存率分别对比如下:49.7%vs 83.1%、20.9%vs 60.2%、6.3%vs 31.8%。即使根据AJCC分期和癌性成分分化程度进行分层分析,这种趋势依然存在(all p<0.01)。利用Cox 比例风险回归模型分析发现肉瘤样HCC病理亚型是HCC患者术后复发(HR,2.355;95%CI,1.564-3.546;p<0.001)和死亡(HR,3.140;95%CI,2.032-4.851;p<0.001)的独立危险因素。3.对转移淋巴、癌栓和肝内病灶行病理学检查,结果发现:33枚淋巴结受检淋巴结中,26(78.8%)枚淋巴结仅含癌性成分,5(15.1%)枚淋巴结同时包含肉瘤样和癌性两种成分,仅2(6.1%)枚淋巴结由纯肉瘤样成分组成;6个癌栓中,仅2(33.3%)个含有肉瘤样成分;6例伴有卫星灶的病例中,只在2(33.3%)例患者的卫星灶中发现肉瘤成分;10例肝内多发病灶患者,其中2(20%)例患者的肝内病灶都含有肉瘤样HCC,其余8例只在其中一个病灶中发现肉瘤样HCC。4.根据肉瘤样成分占据肿瘤体积的百分比,将41例肉瘤样HCC患者划分为3个亚组:混合组≤50%,n=14例;混合组>50%,n=16例;纯肉瘤组,n=11例;Kaplan-Meier生存曲线显示3组间OS和RFS均无明显差异(all p>0.05)。结论:1.大多数肉瘤样HCC患者有慢性病毒性肝炎和肝硬化背景,对这些高危患者定期筛查,有助于早期发现肿瘤并降低死亡风险。2.肉瘤样HCC患者就诊时常常处于疾病中晚期,伴有非特异性症状,大多数病例血清AFP不升高和表现为非典型的动态强化影像特征。3.肉瘤样HCC是一种高侵袭性病理亚型,容易侵袭周围脏器、淋巴结转移、肿瘤坏死和包膜缺失。4.肉瘤样HCC的预后比高级别HCC差,该亚型是HCC患者术后复发和死亡的独立危险因素。5.肉瘤样HCC的癌性成分可能存在“前肉瘤样”状态,从而介导肉瘤样HCC的高度侵袭性。