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多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）通常是由PPO家族多基因成员编码的氧化酶。PPO引起的酶促褐变是造成鲜果和食物在加工中大量损失的主要原因之一。抑制PPO基因表达可以达到降低马铃薯块茎褐变的效果，然而PPO基因家族中每个成员对褐变的贡献却未见报道。本文中，采用人造小RNA（amiRNA）技术抑制了PPO家族中的单个和多个成员，以研究不同PPO基因对PPO总蛋白表达水平、PPO酶活性、块茎褐变潜力的影响。试验中，还检索了马铃薯最新基因库中所有可能存在的PPO基因；评估了马铃薯看家基因稳定性；定量分析了PPO各成员的表达；amiRNA的瞬时表达与稳定的转基因表达的关系。研究内容和主要结果如下：1.马铃薯不同组织间看家基因的筛选和多酚氧化酶基因表达的研究采用geNorm和绝对定量的方法评估马铃薯不同组织间看家基因actin，cyclophilin，cytoplasmic ribosomal protein L2(L2)，elongation factor1-α (ef1α)和β-tubulin的稳定性。结果表明，在马铃薯不同生长阶段中，相同组织内的看家基因表达量相对稳定；然而在马铃薯三个品种的不同组织间，看家基因表达却不稳定。结合前人结果，我们推荐不同组织间，待测基因表达的测定应采用绝对定量法。分析马铃薯基因组数据得到9个PPO基因类似基因，称为StuPPO1至StuPPO9。StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4分别对应先前报道的POTP1/P2，POT32，POT33和POT72，为马铃薯主要表达的PPO基因。StuPPO5-StuPP8在ESTs数据库的数据相当少；而StuPPO9则表达于被病原体侵染的马铃薯组织中。经RT-qPCR绝对定量分析，StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4基因在组织间的分布具有差异性，如StuPPO1主要在嫩叶和块茎外皮层区表达，StuPPO2和StuPPO3则在马铃薯块茎中大量表达。不同组织中PPO基因表达量占整个植株PPO基因表达量的比例不同。如，在嫩叶和块茎中，PPO基因表达量占整株植物PPO表达量的88-96%；在成熟叶片中，PPO基因表达量仅占0.1-5%；在茎中PPO基因表达量占3-10%。在马铃薯三个品种的PPO基因表达总量也不同，比例为Alt1762：Siglinde：Warba=2.0：1.6：1。PPO在这三个品种中，同样表现出组织特异性。作为前期的准备实验，我们发现，在全部组织样本中，StuPPO3和StuPPO4的表达量明显低于StuPPO1和StuPPO2。为了保证被沉默的PPO mRNA表达量仍在RT-qPCR的敏感范围内，后续实验中选用马铃薯块茎作为主要试材。因为StuPPO3和StuPPO4基因在块茎中大量表达，分别占全部五个组织表达量的83.3%和63.3%；同时块茎中StuPPO1和StuPPO2表达量也处于较高水平。2.采用amiRNA技术抑制马铃薯多酚氧化酶基因和马铃薯褐变的研究采用amiRNA技术抑制PPO家族（StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4）的单个或多个基因，以调查不同PPO基因对PPO总蛋白表达水平、PPO酶活性、块茎褐变潜力的贡献。在转基因马铃薯块茎中一个或多个PPO表达的降低通常不引起其他的PPO基因表达升高，但PPO（s）基因表达降低引起了PPO蛋白表达的降低。马铃薯块茎中，不同的PPO基因对PPO总蛋白量的贡献不同，StuPPO2的贡献量最高，可以达到55%左右；StuPPO1次之，约占25-30%；而StuPPO3和StuPPO4两个基因仅占少于15%。PPO蛋白水平、PPO活性和褐变潜力间具有高度正相关性。同时抑制StuPPO2、StuPPO3和StuPPO4基因表达可以得到低PPO酶活性、低度褐变潜力的马铃薯块茎。然而，同时抑制StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4基因可以最大限度的降低PPO酶活性和褐变潜力。总之，StuPPO1，StuPPO2，StuPPO3和StuPPO4基因均对块茎组织的褐变反应有影响，但影响效果并不一致。不同PPO基因的调控机制很可能是相互独立的，这表明了它们功能的多样化。实验结果表明，amiRNA技术可以用来抑制高度保守的多基因家族成员，为研究非模式植物中基因家族的各成员功能提供了一种新思路。此外，本实验得到一系列PPO基因沉默的马铃薯植株，可为后续研究PPO基因功能，如，在植物生长、抗逆性、抗病虫害、次生代谢等方面，提供重要的材料支持。3.瞬时表达系统可快速筛选稳定表达的amiRNA载体转基因植物中，不同amiRNA载体的表达效率很难预测。本实验，使用农杆菌瞬时表达系统和稳定的植物转基因表达系统，检测了以拟南芥miR168a前体RNA为骨架合成的amiRNA表达情况。结果表明，如果农杆菌侵染后amiRNA瞬时表达量高，那么经植株基因转化后amiRNA的表达量也高。因此，体内瞬时表达系统可快速、有效地预测和筛选适于稳定表达的amiRNA，避免了制成转基因作物后筛选的耗时费力程序。