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目的和意义多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一,发生率占血液系统恶性肿瘤的10%左右,随着人口的老龄化,该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。目前,所有的治疗手段包括化疗、放疗、造血干细胞移植以及一些新型的分子靶向药物。但迄今为止MM仍是一种不可治愈性疾病。研究显示,蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib/PS-341,商品名VELCADE?)可诱导包括地塞米松、美法仑以及沙利度胺耐药MM细胞在内的MM细胞产生凋亡,已在MM的治疗中显示出了较好的疗效。其主要作用机制为通过靶向性作用于泛素-蛋白酶体系统,抑制核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)的活性以发挥抗肿瘤作用。硼替佐米为哺乳动物细胞中26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂,化学名为:[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸,分子式C19H25BN4O4,相对分子量384.24。它是首个获美国FDA批准用于MM临床治疗的蛋白酶体抑制剂,具有特异性强效、高效的特点。Mateos等报道,采用硼替佐米联合MP(VMP方案)治疗60例65岁及以上的老年初诊MM患者,总反应率为89%,CR率为32%,16个月的无事件生存率(EFS)为93%;而历史对照的MP方案总反应率为42%,l6个月的EFS为5l%。2008年NCCN骨髓瘤诊疗指南中也推荐将VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替佐米+地塞米松+阿霉素)、MPV(美法仑+强的松+硼替佐米)用于初发及移植候选的MM患者。对于难治/复发的MM患者2008年NCCN指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为I类推荐,硼替佐米+地塞米松方案作为2A类推荐。然而,硼替佐米尚不能根治MM,且随着其临床应用范围的扩大和时间的推移,国内外临床研究已发现部分MM患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的MM患者中出现耐药及疾病的复发,从而影响了硼替佐米的疗效。目前,研究发现MM患者中硼替佐米耐药主要与NF-κB途径、热休克蛋白及BCL蛋白家族的过表达现象有关。因此,继续寻找有效方案以预防耐药的发生或根除恶性浆细胞克隆,是目前研究的一个热点。目前,国内外关于硼替佐米的耐药机制研究尚少,其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在MM细胞中的表达与硼替佐米诱导MM细胞凋亡间的相关性,研究显示MRP3和MRP5的表达不足以遏制硼替佐米诱导产生的凋亡作用,从而提示硼替佐米可能并非为多药耐药转运蛋白的底物。这就提示,硼替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多药耐药。因此,如果能建立硼替佐米耐药的MM细胞株,可以深入研究硼替佐米可能的耐药机制,为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗MM,监测和避免治疗中耐药的发生提供实验依据;同时,为抗耐药药物的筛选提供细胞模型,以期达到逆转耐药提高疗效的目的。为此,本研究拟通过建立硼替佐米耐药的MM细胞株,对其进行基因组学及差异蛋白组学的研究以期初步探讨其可能的耐药机制,为临床克服硼替佐米耐药提供细胞模型及实验依据。本研究包括以下两个部分:第一部分硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立及其基因表达谱研究方法:采用浓度递增的方法自MM细胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐药株NCI-H929B。MTT实验测得硼替佐米对亲本NCI-H929和NCI-H929B 24h的IC50值。流式细胞术分析两种细胞的细胞周期分布情况。提取NCI-H929、NCI-H929B两种mRNA分别变性及逆转录至cDNA,进行基因表达谱分析。对基因表达谱数据,进行GO-分析和Pathway-分析,从中发现可能与耐药相关的信号通路,及其相互激活关系。采用实时定量PCR技术,对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8,MAP3K5、Hsp86)进行验证。并选取Caspase 8抑制剂进行干预,检测亲本NCI-H929细胞系对硼替佐米的IC50变化情况。结果:采用浓度递增法自MM细胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐药株NCI-H929B。MTT实验测得硼替佐米对亲本NCI-H929和NCI-H929B 24h的IC50分别为20.7nmol/L和487.4nmol/L,耐药倍数为23.5。流式细胞术分析显示亲本NCI-H929和NCI-H929B的细胞周期分布无显著性差异。提取亲本NCI-H929、NCI-H929B两种mRNA分别变性及逆转录至cDNA,进行基因表达谱分析,结果显示与亲本NCI-H929相比,在NCI-H929B中有317个基因表达上调,而356个基因表达下调。对基因表达谱数据,进行GO-分析和Pathway-分析,从中发现可能与耐药相关的信号通路,及其相互激活关系,结果提示凋亡通路、细胞周期等信号通路可能与硼替佐米耐药的产生相关。采用实时定量PCR技术,对重要通路上相关基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8,MAP3K5、Hsp86)进行验证。当候选基因在耐药株中表达/亲本细胞中表达≥1.5时,则认为该基因为过表达,若是≤0.5则判定该基因为低表达,结果显示在NCI-H929B细胞株中FADD、Casp8,MAP3K5表达下调,而Hsp86表达上调。采用Caspase 8抑制剂进行干预,检测亲本NCI-H929细胞系对硼替佐米的IC50变化情况,结果显示加入抑制剂后,NCI-H929细胞系对硼替佐米的IC50增高4.37倍。结论:通过体外浓度递增法可建立蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的MM细胞株。亲本NCI-H929和NCI-H929B的生长曲线和细胞周期分布无显著性差异。基因表达谱及Pathway分析显示亲本NCI-H929和NCI-H929B细胞系间存在多个差异表达基因,而凋亡、细胞周期通路在耐药的产生中可能起着重要作用。Caspase8的表达受抑制可能是耐药细胞株产生耐药的重要因素之一。第二部分硼替佐米敏感与硼替佐米耐药骨髓瘤细胞差异蛋白质组学研究方法:提取NCI-H929、NCI-H929B两种细胞的蛋白,采用双向电泳及质谱鉴定技术,分析差异蛋白的表达情况。并选取其中部分差异蛋白,采用western-blot技术进行验证。留取临床患者原代标本,进行western-blot检测,进一步验证双向电泳结果,并分析差异蛋白与硼替佐米耐药的相关性。结果:通过双向电泳及质谱鉴定后共鉴定出14个差异蛋白,与亲本NCI-H929细胞相比,在NCI-H929B中上调的蛋白质点有11个,分别为HSP75、α烯醇化酶、蛋白二硫化物异构酶A3、磷酸化应激诱导蛋白1、膜联蛋白A1、脱氧核糖核酸酶TATDN1、HSPβ-1、蛋白DJ-1、微管蛋白β-6、角蛋白KRT1、加帽蛋白Zβ;下调的蛋白质点有3个,分别为腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP合成酶β亚单位和Rho-GDP解离抑制因子β。通过western Blot技术检测了在NCI-H929B双向电泳中显示为高表达的蛋白DJ-1,结果显示NCI-H929B中蛋白DJ-1表达水平增高。采用CD138磁珠分选技术获得7名MM患者的原代MM细胞标本,通过western Blot技术检测显示硼替佐米耐药的原代MM细胞标本中蛋白DJ-1表达水平高于硼替佐米敏感的原代MM细胞。结论:通过双向电泳技术显示在亲本NCI-H929和NCI-H929B间存在多个差异表达的蛋白,western Blot技术验证了其中一个在NCI-H929B中高表达的蛋白DJ-1,结果显示NCI-H929B和耐药患者的原代MM细胞中蛋白DJ-1表达水平增高,提示蛋白DJ-1的高表达可能与硼替佐米的耐药相关。