背景：神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童期最常见的起源于交感神经系统的颅外恶性实体肿瘤，由发育中的脊髓外层迁移过来的神经母细胞或原始神经嵴细胞衍化而成，其发病率为1／10万，在小儿恶性肿瘤中居第三位，占所有小儿恶性肿瘤病死率的15％，具有恶性程度高、侵袭力强、晚期病例多和治疗效果差的临床特点。其临床特点具有多样性，发病年龄小于1岁的患儿分期通常较好，对化疗敏感，治愈率高，部分患儿有肿瘤的自发消退；而发病年龄大于1岁的患儿，75％有远处转移，经常转移的部位有骨、肝脏、皮肤、骨髓和淋巴结等，这类患儿肿瘤恶性程度高，尽管采用外科手术、化疗和骨髓移植等综合治疗措施，还是经常复发和转移。在先天性畸形和感染性疾病诊治水平明显提高的现代社会，NB已成为威胁儿童生命的一个常见原因。为此，如何提高NB的临床研究和诊治水平，已引起国内外学者的普遍关注。近20年来，NB发病的分子机制的研究取得很大进展，治疗方法亦有许多改进，但临床疗效并无多大提高。然而，NB的自然退化这一奇特现象却引起了人们的极大关注。肿瘤的自然退化是指在极少甚至无系统治疗的情况下肿瘤自行缩小乃至消失的现象。在人类肿瘤中，NB的自然退化最多。死于其他原因的成熟胎儿或新生儿的尸检中，在显微镜下可发现某些个体神经母细胞结节残留，称为原位NB。其在形态学和细胞学上与典型的NB相同，只是体积微小且无转移。这种原位NB的检出率比临床发现的新生儿NB高出约40倍，且3个月以上婴儿未见原位NB，说明部分病例在生后数月发生了自然退化。少数NB能自然分化成神经节细胞瘤，这一自然退化过程是NB的重要特征。自然退化多发生在新生儿及婴儿期，对于国际分期中的特殊四期患儿，虽然已经发生远处转移(肝、骨髓等)，却预后良好，且有较高的自消率。因此，人们设想诱导NB细胞分化、凋亡可能比直接杀伤肿瘤细胞更合乎自然。NB具有的自行消退逆转的独特生物学特性，为分化诱导疗法提供了理论依据，NB被认为是最有希望用以揭示肿瘤逆转自然过程的肿瘤，有助于最终采取措施抑制其恶性进程，如何利用人为方法使NB细胞分化、逆转、消退，是当今肿瘤研究的热点问题。分化诱导是指恶性肿瘤细胞在体内外分化诱导剂作用下，重新向正常方向分化、逆转的现象。体外研究发现，能诱导NB分化的物质有维甲酸(retinoic acid，RA)，干扰素(interferon，IFN)，二丁基环磷酸腺昔，苯乙酸钠等，其中研究最多的是RA。RA及其受体具有控制细胞分化、增生和凋亡的能力，用RA来治疗NB，使其发生逆转是近来研究的热点。9—顺式维甲酸(9-cis retinoic acid，9-cis RA)，13—顺式维甲酸(13-cis retinoic acid，13-cis RA)及全反维甲酸(alltrans rctinoic acid，at RA)是RA的3种同功异构体。NB细胞系的实验表明，9-cis RA在诱导维甲酸受体(Retinoic Acid Receptor，RAR)表达、阻止NB增殖和产生连续的形态学分化方面均更为有效，而且能引起细胞凋亡，因此前景最被国外专家看好。而国内同行们多集中局限于at RA的研究，对9-cis RA涉及甚少，更未查见其应用于NB的实验研究报道。诱导剂单独使用剂量较大，副作用明显，且耐药细胞株的出现也影响了疗效。研究发现已知的分化诱导剂诱导肿瘤分化的机制不同，可能包括受体机制、酶学机制、免疫增强机制、基因表达调控机制及凋亡机制等。RA诱导NB分化最早的特征性变化是降低MYCN基因转录。用MYCN基因互补的寡核苷酸封闭使MYCN不能表达，可降低NB增殖诱导其分化，说明对MYCN基因的调节是RA诱导分化的重要环节。与此相似，γ-干扰素(gamma-interferon，γ-IFN)在体内外实验中可下调MYCN表达，并与RA有协同作用，RA和IFN分别属于外源性和内源性诱导分化剂，两者启动MYCN的机制不同，为联合应用IFN和RA提供了证据。二者联合应用，可以提高肿瘤对诱导剂的敏感性，从而降低单药剂量，减少毒副作用，也可提高治疗效果。近年来，广大科研人员对影响NB预后的分子因素进行了广泛深人研究，发现肿瘤细胞的DNA、RNA倍体和增殖周期、MYCN和多药耐药基因(multidrug resistance gene，MDR)的表达等，均与NB的发生、发展、转移、消退及预后密切相关。因此，通过对这些指标的监测，可以揭示诱导分化剂诱导NB细胞分化和凋亡的分子生物学机制，客观的评价RA和IFN的联合应用的疗效，为其进一步的临床应用提供理论依据和指导。手术、化疗和放疗等传统的恶性肿瘤治疗手段虽然对提高患儿的生存率起了很大作用，但这些治疗方法在清除破坏肿瘤的同时，或破坏人体的正常组织器官，或改变人体的正常生理机能，或大量杀伤人体的正常细胞，产生严重的毒副作用，或干扰人体的内分泌功能，从而不同程度地影响了息儿的生活质量和生长发育，也从某种程度上限制了疗效的进一步提高。诱导分化治疗为恶性肿瘤的治疗开辟了一条崭新的途径。由于其基本特点在于通过诱导恶性肿瘤细胞重新分化成为正常或接近正常的细胞来达到治疗肿瘤的目的，不杀伤人体正常细胞因而没有骨髓抑制、免疫抑制等毒性反应，对正处于生长发育阶段、因放疗或化疗的毒副作用影响骨骼发育和生殖功能而直接影响生活质量的儿童肿瘤患儿，诱导分化治疗的临床前景具有特殊的优越性。本实验充分利用了流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitation polymerase chain reaction，FQ-PCR)等当今国际上最先进的分子生物学实验技术、方法和设备，实验设计严谨科学，视点新颖独特，可行性强，实验结果真实可靠，并具有极高的临床应用指导价值。经广泛查阅国内外文献，尚未发现相同的实验研究。在目前对肿瘤的基因治疗存在种种障碍，面临停滞的情况下，诱导分化疗法作为一种崭新的治疗恶性肿瘤的方法，正在成为一个新兴的研究热点，为小儿恶性肿瘤的治疗提供又一种有力的手段，成为小儿肿瘤多学科综合治疗的一个重要组成部分，对提高儿童肿瘤患儿的生存率，尤其是生活质量具有极为重要的积极意义。随着肿瘤细胞诱导分化研究的不断深入，为彻底治愈恶性肿瘤展现了光明的前景。目的：观察9-cis RA联合γ-IFN在体外诱导NB SK-N-SH细胞分化、凋亡过程中细胞形态、生长抑制、细胞周期及MYCN和MDR1基因mRNA表达方面的变化，探讨其联合作用的效果及其分子机理。方法：将SK-N-SH细胞分为A组(对照组)、B组(9-cis RA用药组)、C组(γ-IFN用药组)和D组(9-cis RA和γ-IFN联合用药组)四组，在用药后不同时间分别观察细胞形态学变化，进行分化神经节细胞计数，用Hoechst-PI荧光双染色法观察细胞的凋亡和死亡，用四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyl tetrazolium bromide，MTT)比色法测定肿瘤肿瘤OD值，计算肿瘤细胞抑制率并绘制生长曲线，用FCM碘化丙啶(PI)染色法检测细胞周期分布，用FCM钙依赖性磷脂结合蛋白V和碘化丙啶(Annexin V／PI)双染色法检测肿瘤细胞的凋亡和死亡，用普通逆转录聚合酶链反应(Reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和FQ-PCR方法检测MYCN和MDR1基因mRNA的表达变化。结果：细胞用药3d后，联合用药组细胞出现形态学分化，胞体变小、变圆，长出轴突并逐渐延伸超过胞体，继而相互连接交织成网状，神经节细胞分化率显著高于其它各组(P＜0.05)；MTT比色法测定显示联合用药能显著提高细胞肿瘤细胞抑制率并明显优于单独用药；Hoeches-PI荧光双染色及FCM Annexin V／PI双染色法检测一致显示联合用药对于诱导细胞早期凋亡和坏死具有显著的协同作用；FCM细胞周期动力学分析发现联合用药组肿瘤细胞G0-G1期细胞比率增加，S期细胞比率减少；普通RT-PCR和FQ-PCR检测共同显示联合用药能协同下调肿瘤细胞MYCN和MDR1基因mRNA的表达。结论：9-cis RA联合γ-IFN体外对NB SK-N-SH细胞系的分化、生长抑制、凋亡和死亡能产生明显的协同作用，在小剂量的情况下即能起到显著的治疗效果，明显优于其单独用药。其协同作用的机制可能为以互补的方式共同下调MYCN和MDR1基因mRNA的表达，一方面抑制其原癌基因的恶性生物学表现，另一方面预防多药耐药，为其联合应用于临床提供理论依据和指导。NB的诱导分化疗法作为一种新型的肿瘤治疗方式，以其高效、低毒、应用方便的特点，为临床手术提供了良好的辅助，为从根本上治愈恶性肿瘤展现了光明的发展前景。