论文部分内容阅读
背景红色毛癣菌在感染人体时主要侵袭皮肤的角质层,这个现象提示皮肤角质形成细胞可能在红色毛癣菌感染中发挥重要的免疫调控作用,并且大部分的角质形成细胞只能通过不依赖接触菌体的方式参与抗感染免疫,因此,和菌体表面的病原相关分子模式相比,红色毛癣菌游离性病原相关分子模式可能发挥更重要的免疫调控作用。现在有很多研究表明,包括红色毛癣菌在内的皮肤癣菌的培养上清,可以有效地刺激角质形成细胞产生免疫应答,但这些研究都是采用完全培养基,在这些培养基中红色毛癣菌可以直接利用小分子营养物质,不需要粘附和侵袭宿主的角蛋白,因此在这种培养条件下,其免疫原性和致病性和活体感染有很大区别,可能无法真实的反映红色毛癣菌感染人体时所产生的游离性病原相关分子模式对角质形成细胞天然免疫的影响。在本次研究中,我们采用以指甲作为唯一碳源和氮源的培养基体外培养红色毛癣菌,在这一培养基中,红色毛癣菌必须粘附、侵袭角质才能生长,更好的模拟了红色毛癣菌感染人体的真实情况,通过此种培养方式获得的上清液来研究红色毛癣菌释放的游离性病原相关分子模式对角质形成细胞的免疫调节作用。目的分析红色毛癣菌指甲培养上清对角质形成细胞天然免疫应答的影响,并比较不同菌株的差异。方法本实验使用了两株红色毛癣菌,红色毛癣菌标准株CMCC#T1a,由中国卫生部微生物菌种保藏管理中心医学真菌中心赠予。菌株TXHB是从一名体癣患者身上分离出来的临床株。在无机盐溶液中加入正常人的指趾甲粉末作为培养基碳源和氮源的唯一来源,体外振荡培养红色毛癣菌,过滤除菌并超滤浓缩获得培养上清。研究采用以下方法：1.采用鲎G因子试剂盒检测两株菌培养上清液中的β-葡聚糖(一种最常见的病原相关分子模式)的含量。2.用BCA蛋白定量法检测上清液蛋白浓度,通过细胞形态学方法确定与细胞共孵育的上清液浓度。3.通过相对定量qPCR测定HaCaT的抗真菌感染免疫密切相关的模式识别受体(Dectin-1, TLR2, TLR4, DC-SIGN)、Dectin-1的下游信号通路分子CARD9、在皮肤中组成性表达的抗菌肽RNase7和中性粒细胞趋化因子IL-8的mRNA表达水平结果1.红色毛癣菌T1a和TXHB的培养上清中分别含有87.530±37.581pg/ml和15.747±6.453 pg/ml的β-葡聚糖。2.HaCaT用蛋白终浓度大于40 μg/ml的红色毛癣菌T1a上清处理24 h,细胞开始脱落,多核细胞增加,开始出现明显的细胞毒性。两株红色毛癣菌菌株上清的蛋白终浓度20μg/ml处理HaCaT,在48h内细胞形态均保持正常没有受到严重伤害,因此我们用蛋白终浓度为20μg/ml的红色毛癣菌上清刺激HaCaT。3.与同时间点的阴性对照相比,T1a或TXHB上清短时间孵育6h可以引起HaCaT的TLR2、TLR4和CARD9的mRNA表达的低强度上调(p<0.05)。不过,HaCaT对T1a培养上清的应答比对TXHB的更加显著。T1a在6h和24 h时都上调了CARD9的表达,比TXHB的6h的上调时间更长,上调幅度都在2倍左右(p<0.05)。DC-SIGN的mRNA在T1a上清刺激3h和6h以后上调,表达量是阴性对照的2-4倍,而TXHB上清引起的上调发生在24 h,上调幅度较低(p<0.05)。在T1a上清的刺激下,Dectin-1在6h有低强度的上调,但在48 h时显著下调,但是用TXHB上清刺激却没有引起任何显著变化(p<0.05)。IL-8表达在T1a上清刺激6h以后,上调幅度是阴性对照的2倍左右,而在TXHB上清的刺激48h时下调(p<0.05)。RNase7在T1a上清刺激24 h和48 h时(p<0.05)的表达下调,下调幅度是阴性对照的一半左右,但是用TXHB上清刺激却没有引起任何显著变化。结论1.红色毛癣菌的指甲培养上清可以直接刺激角质形成细胞产生有效的天然免疫应答,但是应答强度低而且应答时间短暂。这可能是红色毛癣菌病的慢性化和易复发性的原因。2.红色毛癣菌的指甲培养上清中含有β-葡聚糖,一种最常见的PAMPs,但在两株菌的培养上清中的含量太低,无法有效诱导、维持角质形成细胞的炎症反应。3.红色毛癣菌不同菌株对角质形成细胞天然免疫应答的调节能力存在种内差异性。