活性氧自由基(ROS)参与生物体的诸多生理、病理学过程,包括细胞信号转导、细胞的程序性凋亡、机体的衰老等。其中,超氧阴离子自由基(O2·-)是生物体系内首先产生的ROS,是其他ROS的前体。O2·-浓度的波动与诸多生物学过程和疾病的发生发展密切相关,因此,对细胞和活体内O2·-浓度进行实时、原位、定量的检测至关重要。真核细胞中含有多种不同的细胞器,这些细胞器相互独立又彼此依存,各种细胞器协同作用以完成细胞中复杂的新陈代谢活动。线粒体是细胞中O2·-的主要产生位点,对线粒体中O2·-的研究有利于揭示O2·-在线粒体涉及的生物学过程中的重要作用。内质网作为各种蛋白质折叠反应发生的重要场所,在蛋白质的氧化还原过程中会伴随O2·-的产生,然而,内质网中O2·-水平变化与内质网的生物学功能及内质网相关疾病的关系仍然不为人知。因此,急需发展能够用于高灵敏度和高选择性检测这些细胞器内O2·-浓度变化的新方法。荧光成像技术具有诸多优势,如灵敏度高、对生物样本损害小、时空分辨能力高等。近年来,双光子荧光显微镜(Two-Photon Excited Fluorescence Microscopy,TPM)技术在生物成像领域的应用发展迅速,与传统的荧光显微镜相比,TPM具有组织穿深更大、组织自发荧光和自吸收更低、光损伤和光漂白影响更小等优点。发展用于亚细胞器及活体中O2·-的双光子荧光成像分析方法将会有助于研究O2·-的生物学作用。然而,目前仍然缺少双光子吸收截面较大、光学稳定性好、响应灵敏度和选择性高、可以在亚细胞器定位的O2-双光子荧光探针。基于上述原因,本论文设计合成了两种新型靶向细胞器的O2-双光子荧光探针用于活细胞和活体中O2·-的浓度检测。主要内容如下:1、设计合成了一种新型定位内质网检测O2·-的双光子荧光探针“ER-BZT”,探针具有灵敏度高、选择性好、稳定性高、毒性低的优点。利用该探针对不同刺激下细胞内质网中O2-水平变化进行了单、双光子荧光成像检测;此外,还利用该探针对活体中的O2·-进行了双光子荧光成像检测,证明,小鼠患糖尿病后腹腔和肝脏中的O2·-浓度会上升。2、设计合成了一种定位线粒体检测O2·-的双光子荧光探针“Mito-CA”。该探针利用咖啡酸与O2·-的特异性识别反应检测O2·-;选择带正电荷的三苯基膦结构为定位基团。