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Wada等在1996年发现高压氧预处理可诱导沙土鼠前脑缺血耐受,从而提出了高压氧预处理这一减轻缺血再灌注损伤的方法。继Wada等之后的大量研究证实高压氧预处理除了在大脑诱导缺血耐受外,还可以在其它脏器如:心脏、肝脏和脊髓诱导缺血耐受,减轻脏器的缺血再灌注损伤。虽然高压氧预处理减轻脏器缺血再灌注损伤的方法效果明显,但其具体机制尚不清楚。为阐明高压氧预处理减轻脏器缺血再灌注损伤的机制,使其能够尽快适用于临床,本实验室以脊髓为研究对象开展了一系列研究。现有的研究证明(1)重复高压氧预处理可诱导兔脊髓的缺血耐受;(2)高压氧预处理诱导缺血耐受过程中起主要作用的是高分压氧因素而不是高压因素;(3)氧自由基清除剂二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)可消除高压氧预处理诱导的脊髓缺血耐受效应;(4)高压氧预处理过程中产生的活性氧上调内源性抗氧化酶活性,增强机体清除氧自由基的能力,从而减轻缺血再灌注损伤;(5)高压氧预处理能够缓解缺血再灌注过程中线粒体ATP酶活性的下降,维持线粒体功能。根据以上体外实验的结果,我们发现缺血耐受效应的产生有赖于高压氧预处理过程中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成,这些生成的活性氧作为预刺激,通过提高机体抗氧化酶活性,上调机体的抗氧化能力,维持线粒体功能而产生保护效应。但是,高压氧作用于机体期间,会产生一系列复杂的生理反应,我们无法知道高压氧预处理诱导脊髓的缺血耐受是直接作用还是一系列生理反应后的间接作用。确切的说就是高压氧预处理对脊髓神经元是否具有直接的保护作用。为了回答上述问题,从而进一步阐明高压氧预处理诱导脊髓缺血耐受的机制,我们设计了本实验。本研究利用双氧水(hyperbaric oxygen, H2O2)导致的氧化损伤模拟脊髓的缺血再灌注损伤,采用原代培养的小鼠脊髓神经元对高压氧预处理诱导脊髓缺血耐受的机制进行两方面探讨:(1)高压氧预处理对脊髓神经元的氧化损伤是否具有保护作用;(2)如果具有保护作用,那么这种保护作用的形成机制是什么。为了探讨以上问题,我们以原代培养的胚胎小鼠脊髓神经元为实验模型,首先对神经元进行了纯化和鉴定,同时采用组织病理学、免疫组织化学等方法观察脊髓神经元的形态学特征;采用细胞活力检测、单细胞凝胶电泳等方法观察高压氧预处理对脊髓神经元氧化损伤的保护作用;采用western blot、RT-PCR等方法分别从蛋白和基因水平检测高压氧预处理后脊髓神经元抗氧化酶的表达水平,对高压氧预处理诱导脊髓神经元缺血耐受的机制进行了初步研究;利用抑制剂锡原卟啉(tin-mesoporphyrin, SnMP)特异性阻断血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)活性,结合MTT(methyl thiazoleterazolium)实验和“彗星”实验观察SnMP对高压氧预处理诱导脊髓神经元保护作用的影响,对高压氧预处理诱导脊髓神经元缺血耐受的机制进行深入探讨,其主要结果如下:(一)建立了可靠的胚胎小鼠脊髓神经元原代培养方法胚胎小鼠脊髓神经元在含10%胎牛血清的DMEM培养液中,可健康存活10d以上,在整个培养过程中,神经元形态良好,生长正常。在培养的4d～6d间神经元形态保持最好,细胞活力最高。采用抗β-tubulin的单克隆抗体进行免疫组化染色鉴定表明,神经元所占培养细胞比例大于90%。(二)H2O2处理导致神经元氧化损伤25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L四个浓度组H2O2作用于培养5d的脊髓神经元1h,其活性与对照组神经元活性相比分别为:81±9.85%、53±9.03%、34±6.61%和21±5.13%。各组神经元DNA损伤后形成的尾矩分别为:0.235±0.051,0.455±0.089,0.538±0.079和0.762±0.112。与对照组神经元尾矩0.056±0.011相比均有显著性差异(P<0.05, n=3)。脊髓神经元在H2O2作用下出现明显的损伤,其中在50μmol/L的H2O2作用下,神经元相对活性降低了大约一半,符合实验要求,因此我们选择50μmol/L作为H2O2的作用浓度。(三)高压氧预处理对脊髓神经元具有保护作用1)高压氧预处理对脊髓神经元活力的影响H2O2作用导致细胞活力下降,在高压氧预处理后各时间点(1h、4h、8h、12h、24h),H2O2组与对照组相比光密度值均明显降低(P<0.05)。在高压氧预处理后1h,HBO+H2O2组与H2O2组相比光密度值无差异(P>0.05)。在预处理后4h,H2O2组光密度值为0.121±0.011,HBO+H2O2组光密度值则显著升高到0.251±0.073(P<0.01 versus H2O2 group)。从预处理后4h开始,光密度值明显增高,12h达到高峰(0.432±0.056),并且一直持续到预处理后24h。2)高压氧预处理对脊髓神经元DNA损伤的影响H2O2作用导致神经元DNA损伤,表现为尾矩增高。在高压氧预处理后各时间点(1h、4h、8h、12h、24h),H2O2组与对照组相比尾矩均明显增高(P<0.01)。在高压氧预处理后1h,HBO+H2O2组与H2O2组相比尾矩无差异(P>0.05)。在预处理后4h,H2O2组尾矩为0.515±0.085,HBO+H2O2组尾矩则显著降低到0.381±0.096(P<0.01 versus H2O2 group)。从预处理后4h开始,HBO+H2O2组尾矩明显下降,并且一直持续到预处理后24h。(四)高压氧预处理诱导脊髓神经元HO-1表达1)高压氧预处理诱导HO-1蛋白表达以β-actin作为内参照,HO-1蛋白在HBO处理前表达很少,只有β-actin的0.15倍。HBO处理后1h, HO-1蛋白表达量无明显变化。HBO处理后4h开始HO-1蛋白表达明显增多(0.66, P<0.01 versus control),直至处理后8h表达量达到高峰,为β-actin的1.44倍。随后,HO-1蛋白逐渐减少,但是在HBO处理后24h其表达量仍比处理前高。HBO预处理前后SOD表达量无明显差异(P>0.05)。2)高压氧预处理诱导HO-1基因表达以β-actin作为内参照,HO-1 mRNA水平在HBO处理前较低,为β-actin的0.5倍。高压氧预处理后1h,HO-1 mRNA水平明显增高(1.09, P<0.05 versus control),8h达到高峰,为β-actin的1.88倍。随后,HO-1 mRNA水平开始减少。β-actin mRNA的水平在组间无明显差异(P>0.05)。(五)SnMP消除高压氧预处理对脊髓神经元的保护作用在对照组用10μmol/L SnMP处理过的神经元,其光密度值和细胞尾矩与未处理细胞相比无明显差异(P>0.05)。在H2O2组,SnMP处理对脊髓神经元的光密度值和细胞尾矩无明显影响。在HBO+H2O2组细胞光密度值出现明显变化,SnMP未处理神经元光密度值为0.351±0.054,SnMP处理的神经元光密度值为0.203±0.041,两者之间有显著性差异(P<0.01)。SnMP未处理神经元尾矩为0.208±0.066,SnMP处理的神经元尾矩显著升高到0.507±0.098(P<0.01 versus the neurons without SnMP treatment)。总之,通过本实验的研究观测,证明H2O2处理可使脊髓神经元发生氧化损伤,表现为细胞活力下降,细胞DNA断裂。高压氧预处理可以有效预防脊髓神经元的氧化损伤,提高神经元活性,减轻细胞DNA损伤。高压氧预处理后脊髓神经元HO-1在蛋白和基因水平表达都升高,且HO-1表达增高与高压氧预处理对神经元的保护作用在时间上是平行的,提示HO-1与高压氧预处理诱导的保护作用有关。进一步使用HO-1抑制剂SnMP进行实验,结果证明HO-1直接参与了高压氧预处理对脊髓神经元的保护作用。从体外进一步证明了高压氧预处理诱导脊髓缺血耐受的现象,并对其机制进行了探讨。在上述实验的基础上,进一步的研究应重点探讨在体外实验条件下,高压氧预处理通过何种途径影响HO-1表达及其对其它抗氧化酶表达的影响和机制。