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为了研究河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)特异性结合镉离子(Cadmium,Cd2+)的MT亚型(Cd2+specificbindingmetallothioneinsofS.henanense,ShCdMT)、特异性结合铜离子(Copper,Cu2+)的MT亚型(Cu2+specificbindingmetallothioneinsofS.henanense,ShCuMT)的金属结合特性，本学位论文首先设计了大肠杆菌(Escherichia coli)菌体内、外实验，研究了含有ShCdMT重组菌体的金属耐受性、斑点生长情况以及对培养基中重金属离子的清除效果；采用圆二色(Circular dichroism, CD)光谱扫描、等温滴定微量热(Isothermal titration calorimetry, ITC)变化实验方法，研究了ShCdMT的金属结合特性。其次，为了进一步了解河南华溪蟹ShCdMT的金属结合能力，综合利用电喷雾飞行质谱(Electrospray ionization mass spectrometry with a time-of-flight analyser, ESI-TOF-MS)、电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)、CD扫描和ITC热变化实验技术与手段，分析了Cd-、Cu-、铅(Lead,Pb2+)-和锌(Zinc,Zn2+)-ShCdMT的金属结合化学计量数、Zn-ShCdMT与Cd2+、Cu2+和Pb2+的体外交换反应。还有，为了获得ShCuMT蛋白，在克隆得到了shCumt基因cDNA全长之后，利用DNAMAN、MEGA7.0、Bioedit软件，分析了shCumt的核酸和ShCuMT蛋白氨基酸序列、进化树构建并进行了蛋白质多重序列比对；利用EXPASY在线Protparam和SOPMA软件，解析了ShCuMT蛋白的理化性质和二级结构元件，构建了pET-28a-SUMO-shCumt原核表达载体；利用Ni-NTA亲和层析和凝胶层析，纯化得到了ShCuMT蛋白。最后，为了研究ShCuMT的金属结合特性，利用Cd-、Cu-、和Zn-ShCuMT与DTNB的反应、CD光谱扫描、ITC热变化和ESI-TOF-MS实验方法手段，研究了ShCuMT的金属结合特性。结果包括四个方面：
1.河南华溪蟹ShCdMT的金属结合特性
与对照组相比，含有ShCdMT的重组菌体对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+具有一定的耐受性，对培养基中Cd2+和Pb2+的清除作用呈显著或极显著性降低(P<0.05,P<0.01)。在大肠杆菌体内合成的Cd-ShCdMT具有致密且稳定的三维折叠结构，在体外，ShCdMT能螯合6个Cd2+、7个Cu2+、6个Pb2+。ShCdMT对金属离子结合的稳定性从高到低的顺序是：Cu->Cd->Pb->Zn-ShCdMT。
2.河南华溪蟹ShCdMT与不同金属离子的结合能力
在大肠杆菌体内合成的Zn-、Cd-和Pb-ShCdMT复合物的主要组份是：Zn15-ShCdMT、Cd9-ShCdMT和Pb5-ShCdMT；Zn-ShCdMT中的Zn2+极易被Cd2+、Cu2+、Pb2+取代，分别形成稳定的Cd-S键、Cu-S键和Pb-S键。Zn-ShCdMT具有与apo-ShCdMT一样的金属结合化学计量数，能配位6个Cd2+、7个Cu2+和6个Pb2+；当与Zn-ShCdMT发生交换的Cd2+、Cu2+和Pb2+的数量分别超过6个、7个和6个时，形成的Cd-S键、Cu-S键和Pb-S键的几何结构将发生改变。
3.河南华溪蟹shCumt基因的cDNA克隆、生物信息学分析和ShCuMT蛋白的原核表达
shCumt基因cDNA全长为198bp，shCumt基因cDNA的核酸序列与相近物种的mt核酸序列具有较高的相似性；ShCuMT蛋白含有65个氨基酸，其中，半胱氨酸(Cysteine, Cys)含量有21个，约占总氨基酸含量的32.3%，含有3个CXC保守基序、2个CCC串联基序、1个CX5CXC基序、1个CX3CXC基序和1个CXCX2C基序，但不含任何芳香族氨基酸。有较高含量的甘氨酸(Glycine, Gly)、赖氨酸(Lysine, Lys)和丝氨酸(Serine, Ser)等小分子量氨基酸，理论分子量约为6293Da、等电点8.3，ShCuMT蛋白几乎不含有任何二级结构元件，无规则卷曲的比例占87.69%，ShCuMT蛋白中氨基酸序列与相近物种的特异性结合Cu2+的MT亚型(Cu2+specificbindingmetallothioneins,Cu-MT)或者MT具有较高的相似性，是一种典型的Cu-硫醇(Cu-thioneins)MT蛋白；诱导SUMO-ShCuMT原核表达的最佳IPTG浓度是1mM，诱导表达的最佳时间为8h，经纯化、酶切获得了较纯的ShCuMT蛋白。
4.河南华溪蟹ShCuMT的金属结合特性
ShCuMT表现了较强的金属离子结合特性，ShCuMT与Cd2+、Zn2+和Cu2+结合的稳定性由高到低的顺序为：Cu2+>Cd2+>Zn2+。在酸性条件下，ShCuMT结合Cu2+具有稳定性和唯一性；在大肠杆菌体内合成的Cd-、Cu-和Zn-ShCuMT中的主要组份分别为：Cd19-、Zn19-和Cu32-ShCuMT。体外apo-ShCuMT能够配位6个Cd2+、3个Zn2+和10个Cu2+。在大肠杆菌体内合成的Cd-和Zn-ShCuMT的CD光谱分别在250nm和254nm处出现了一条高斯(Gaussian)带，Cu-ShCuMT在270nm处呈现激联耦合条带，在300-320nm处呈示典型的Cu-thionein特征性吸收条带。
综上所述，得出全文结论如下：
一是，ShCdMT对Cd2+的结合具有偏好性，属于Cd-SpecificMT亚型，具有无脊椎动物MT典型的β/β结构域，能够与二价金属离子形成M6Ⅱ-ShCdMT配位模式，对一价金属离子具有较高的亲密性，在生物体内，ShCdMT具有解除Cd2+的毒性和维持Zn2+内稳态的生物学功能作用。
二是，体内合成的ShCdMT具有较强的Zn2+积累和Cd2+吸收能力，与apo-ShCdMT类似，Zn-ShCdMT与Cd2+和Pb2+能够形成M6Ⅱ-ShCdMT配位模式，与Cu2+形成M7Ⅰ-ShCdMT配位模式。在体内，Zn-ShCdMT能够释放Zn2+，吸收Cd2+、Cu2+和Pb2+，表明Zn-ShCdMT可以介导细胞内Zn2+的转运和解除异质金属离子的毒性作用。
三是，shCumt基因cDNA全长为198bp，编码65个氨基酸，Cys含量占32.3%，理论分子量为6293Da。与其他MT亚型相似，ShCuMT几乎不含任何二级结构元件，等电点呈碱性，氨基酸序列与蓝蟹(Callinectes sapidus)等近源物种具有较高的相似性，进化树推测，ShCuMT是一种典型的Cu-SpecificMT亚型。
四是，ShCuMT与Cu2+结合能够形成折叠致密、稳定的三维空间结构。与Cu2+的结合具有稳定性、唯一性和高化学计量数，是一种典型的特异性结合Cu2+的MT亚型。虽然ShCuMT表现出较强的金属离子结合特性，但是，当异质金属离子入侵时，ShCuMT可能不会表现出解除异质金属离子毒性的作用，而是专一性地发挥维持Cu2+内稳态的作用，从而保证河南华溪蟹体内呼吸色素血蓝蛋白的正常合成。
1.河南华溪蟹ShCdMT的金属结合特性
与对照组相比，含有ShCdMT的重组菌体对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+具有一定的耐受性，对培养基中Cd2+和Pb2+的清除作用呈显著或极显著性降低(P<0.05,P<0.01)。在大肠杆菌体内合成的Cd-ShCdMT具有致密且稳定的三维折叠结构，在体外，ShCdMT能螯合6个Cd2+、7个Cu2+、6个Pb2+。ShCdMT对金属离子结合的稳定性从高到低的顺序是：Cu->Cd->Pb->Zn-ShCdMT。
2.河南华溪蟹ShCdMT与不同金属离子的结合能力
在大肠杆菌体内合成的Zn-、Cd-和Pb-ShCdMT复合物的主要组份是：Zn15-ShCdMT、Cd9-ShCdMT和Pb5-ShCdMT；Zn-ShCdMT中的Zn2+极易被Cd2+、Cu2+、Pb2+取代，分别形成稳定的Cd-S键、Cu-S键和Pb-S键。Zn-ShCdMT具有与apo-ShCdMT一样的金属结合化学计量数，能配位6个Cd2+、7个Cu2+和6个Pb2+；当与Zn-ShCdMT发生交换的Cd2+、Cu2+和Pb2+的数量分别超过6个、7个和6个时，形成的Cd-S键、Cu-S键和Pb-S键的几何结构将发生改变。
3.河南华溪蟹shCumt基因的cDNA克隆、生物信息学分析和ShCuMT蛋白的原核表达
shCumt基因cDNA全长为198bp，shCumt基因cDNA的核酸序列与相近物种的mt核酸序列具有较高的相似性；ShCuMT蛋白含有65个氨基酸，其中，半胱氨酸(Cysteine, Cys)含量有21个，约占总氨基酸含量的32.3%，含有3个CXC保守基序、2个CCC串联基序、1个CX5CXC基序、1个CX3CXC基序和1个CXCX2C基序，但不含任何芳香族氨基酸。有较高含量的甘氨酸(Glycine, Gly)、赖氨酸(Lysine, Lys)和丝氨酸(Serine, Ser)等小分子量氨基酸，理论分子量约为6293Da、等电点8.3，ShCuMT蛋白几乎不含有任何二级结构元件，无规则卷曲的比例占87.69%，ShCuMT蛋白中氨基酸序列与相近物种的特异性结合Cu2+的MT亚型(Cu2+specificbindingmetallothioneins,Cu-MT)或者MT具有较高的相似性，是一种典型的Cu-硫醇(Cu-thioneins)MT蛋白；诱导SUMO-ShCuMT原核表达的最佳IPTG浓度是1mM，诱导表达的最佳时间为8h，经纯化、酶切获得了较纯的ShCuMT蛋白。
4.河南华溪蟹ShCuMT的金属结合特性
ShCuMT表现了较强的金属离子结合特性，ShCuMT与Cd2+、Zn2+和Cu2+结合的稳定性由高到低的顺序为：Cu2+>Cd2+>Zn2+。在酸性条件下，ShCuMT结合Cu2+具有稳定性和唯一性；在大肠杆菌体内合成的Cd-、Cu-和Zn-ShCuMT中的主要组份分别为：Cd19-、Zn19-和Cu32-ShCuMT。体外apo-ShCuMT能够配位6个Cd2+、3个Zn2+和10个Cu2+。在大肠杆菌体内合成的Cd-和Zn-ShCuMT的CD光谱分别在250nm和254nm处出现了一条高斯(Gaussian)带，Cu-ShCuMT在270nm处呈现激联耦合条带，在300-320nm处呈示典型的Cu-thionein特征性吸收条带。
综上所述，得出全文结论如下：
一是，ShCdMT对Cd2+的结合具有偏好性，属于Cd-SpecificMT亚型，具有无脊椎动物MT典型的β/β结构域，能够与二价金属离子形成M6Ⅱ-ShCdMT配位模式，对一价金属离子具有较高的亲密性，在生物体内，ShCdMT具有解除Cd2+的毒性和维持Zn2+内稳态的生物学功能作用。
二是，体内合成的ShCdMT具有较强的Zn2+积累和Cd2+吸收能力，与apo-ShCdMT类似，Zn-ShCdMT与Cd2+和Pb2+能够形成M6Ⅱ-ShCdMT配位模式，与Cu2+形成M7Ⅰ-ShCdMT配位模式。在体内，Zn-ShCdMT能够释放Zn2+，吸收Cd2+、Cu2+和Pb2+，表明Zn-ShCdMT可以介导细胞内Zn2+的转运和解除异质金属离子的毒性作用。
三是，shCumt基因cDNA全长为198bp，编码65个氨基酸，Cys含量占32.3%，理论分子量为6293Da。与其他MT亚型相似，ShCuMT几乎不含任何二级结构元件，等电点呈碱性，氨基酸序列与蓝蟹(Callinectes sapidus)等近源物种具有较高的相似性，进化树推测，ShCuMT是一种典型的Cu-SpecificMT亚型。
四是，ShCuMT与Cu2+结合能够形成折叠致密、稳定的三维空间结构。与Cu2+的结合具有稳定性、唯一性和高化学计量数，是一种典型的特异性结合Cu2+的MT亚型。虽然ShCuMT表现出较强的金属离子结合特性，但是，当异质金属离子入侵时，ShCuMT可能不会表现出解除异质金属离子毒性的作用，而是专一性地发挥维持Cu2+内稳态的作用，从而保证河南华溪蟹体内呼吸色素血蓝蛋白的正常合成。