目的:黄芪是最常用的中药材之一。近年来,由于野生的黄芪资源越来越少,为了满足黄芪的市场需求和减缓黄芪野生资源的采挖对环境的破坏,改善黄芪品质成为学者的研究热点。本研究运用生物信息学和分子生物学等技术,从黄芪转录组数据库中筛选可能参与黄芪三萜皂苷生物合成相关的P450基因,并对部分候选基因进行克隆和载体构建,为基因功能的验证和阐明黄芪皂苷生物合成分子机制奠定基础,同时为黄芪的品质改良提供科学依据。方法:通过de novo RNA测序获得黄芪转录组数据,根据SWISSPROT、KOG、GO、KEGG等数据库的注释和文献查阅等进行综合分析,有文献报道,71clan的P450基因可能与黄芪皂苷生物合成相关,所以筛选出71clan的CYP450基因;黄芪皂苷生物合成上游基因鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)的表达水平与其合成三萜皂苷的下游基因表达水平是相一致的。因此,可以通过测定在对照黄芪毛状根和过表达黄芪鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的黄芪毛状根中的表达量,初步筛选出可能参与黄芪三萜类化合物生物合成的基因,应用q PCR技术筛选出在对照黄芪毛状根和过表达黄芪鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的黄芪毛状根中与SE基因表达一致的P450酶候选基因;通过RACE技术,获得基因末端序列,进一步扩增得到全长基因。同时利用NCBI、SOPMA、TMHMM Server v.2.0等在线工具对克隆得到的Am CYP82D47、Am CYP71A26、Am CYP93A3三个基因的生物学信息进行分析;并将三个基因分别构建到植物表达载体p CAMBIA1302、酵母表达载体p AUR123、p RS424中;将重组质粒转入酿酒酵母中,对工程酵母进行发酵,用HPLC对发酵产物进行了初步检测。结果:(1)推测出属于71clan的36个可能与黄芪三萜皂苷生物合成相关的P450基因,对这36个基因设计q PCR引物,荧光定量分析筛选出在Am SE-OE株系中14个表达量上调的基因。考察了这14个P450候选基因在黄芪的不同组织中的表达水平,其中有9个基因在根中的表达量相对较高,4个基因在叶中的表达量相对较高,1个基因在茎中的表达量相对较高。(2)对这14个候选P450基因,通过RACE技术和全长克隆,最终构建到T载体中的基因有3个,获得p MD19-Am CYP82D47、p MD19-Am CYP71A26、p MD19-Am CYP93A3三个基因的克隆载体。(3)构建完成带有这三个CYP450基因的植物表达载体:p CAM-Am CYP82D47、p CAM-Am CYP71A26、p CAM-Am CYP93A3及三个基因的酿酒酵母表达载体:p RS424-Am CYP82D47、p RS424-Am CYP71A26、p RS424-Am CYP93A3,酵母表达载体转化至酿酒酵母中。(4)对分别带有Am CYP82D47、Am CYP71A26、Am CYP93A3基因的工程酵母菌的发酵产物进行了初步检测。结论:本研究基于黄芪转录组数据,筛选出可能与黄芪三萜皂苷生物合成相关的P450基因36个,得到全长序列7个,将其中3个P450基因构建了植物表达载体和酵母表达载体,酵母表达载体的重组质粒在酿酒酵母中进行转化,并对发酵产物进行了初步检测,后续将通过寻找不同底物或进行发酵条件优化等实验,阐明这三个细胞色素P450基因的功能。