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研究背景结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种发病率较高的消化系统恶性。结直肠癌患者多数因肿瘤远处转移死亡。肿瘤的转移与血管生成增加密切相关。华蟾毒精对抗肿瘤血管生成和抗肿瘤的报道较少,机制不明确。研究目的探究华蟾毒精对肿瘤血管生成及诱导结肠癌细胞凋亡的机制研究,为华蟾毒精治疗结直肠癌的临床治疗提供一定的理论基础。研究方法1、采用鸡胚尿囊膜实验和小管形成实验观察华蟾毒检测华蟾毒精对血管生成的影响;2、采用MTT法,Transwell迁移实验,Hoechst染色法,流式细胞术,JC-1法,DCFH-DA法,Western blot法检测华蟾毒精抗人脐静脉血管内皮细胞HUVEC、结肠癌细胞SW480细胞活性、迁移能力、形态学改变,凋亡率,线粒体膜电位,细胞活性氧水平及凋亡相关、血管生成相关蛋白的影响。3、构建结肠癌原位移植瘤动物模型,观察华蟾毒精抑制肿瘤生长和血管生成效果。研究结果1.华蟾毒精抑制血管生成华蟾毒精作用于鸡胚后0.1 μ M,1 μ M,1 μ M组一级血管分别为2.000±0.707,1.600±0.548,1.400±0.548,少于对照组血管数(P<0.05);二级血管分别为21.400±3.647,15.600±3.362,6.400±2.074 均少于对照组血管数 27.600±3.050(P<0.05)。加药组三级血管同样少于对照组。同时小管形成实验表明华蟾毒精能降低内皮细胞形成管腔的能力,各加药组血管腔的数目少于对照组(P<0.05)。2.华蟾毒精诱导内皮细胞和结肠癌细胞SW480凋亡华蟾毒精呈浓度依赖性降低血管内皮细胞和结肠癌细胞SW480的活性,同时降低内皮细胞和结肠癌细胞的迁移能力。华蟾毒精作用内皮细胞和结肠癌细胞后,细胞出现明显核固缩和凋亡小体现象。流式细胞术显示华蟾毒精呈浓度依赖性诱导内皮细胞和结肠癌细胞出现凋亡。JC-1法和DCFH-DA法显示华蟾毒精降低内皮细胞和结肠癌细胞线粒体膜电位,同时提高细胞内活性氧水平。蛋白免疫印迹法显示华蟾毒精处理人脐静脉血管内皮细胞和结肠癌细胞SW480后,Bax/B cl-2比例上升,caspase-3,caspase-9,PARP均出现片段化。内皮细胞经华蟾毒精处理后,磷酸化AKT、磷酸化mTOR表达下降,同时基质金属蛋白酶MMP-9,缺氧诱导因子Hif-1 α表达下降。3.华蟾毒精能抑制结肠癌原位移植瘤肿瘤生长和血管生成。华蟾毒精干预后,原位移植癌肿块体积和重量均明显减少(P<0.05)。同时,华蟾毒精干预组肿块微血管密度较对照组明显减少(P<0.05)。同时华蟾毒精组和顺铂组肿块均出现凋亡现象。Western blot结果显示华蟾毒精干预组和顺铂组:caspase-9、caspase-3,PARP 出现片段化;磷酸化 AKT、磷酸化 mTOR、Hif-1α表达降低研究结论1.华蟾毒精能抑制血管生成并诱导结肠癌细胞SW480凋亡。2.华蟾毒精可能通过降低AKT、mTOR磷酸化水平和Hif-1 α并诱导内皮细胞凋亡而抑制血管生成。3.华蟾毒精可通过增强Bax表达,激活caspase通路诱导结肠癌细胞凋亡。