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体细胞胚胎诱导发生是培养植物离体再生植株的重要途径之一,因此研究植物体胚诱导、发育和细胞分化的机理等具有重要的理论和实际意义。灵发素(LFS)是一种新型的植物生长调节剂,它既具有细胞分裂素(CTK)的化学结构和生物活性,同时又有生长素的生物活性。不同的植物体胚发生对植物生长调节剂的要求不同,本文从形态学效应、组织解剖、及相关生理生化指标等方面研究LFS与其它常用植物生长调节剂(BA、2,4-D、NAA和LFS+NAA)对半复体胚发生的影响及差异,并依此探讨LFS诱导药用植物半夏体细胞胚胎形态建成的机制。所获主要结果如下:
1、以MS+LFS(O.3mg/L)为培养基,诱导半夏体细胞胚胎发生时,以叶柄作为外植体最佳,叶片次之,块茎几乎不能诱导体胚的发生。2@2、以MS为基本培养基,分别添加LFS(0.3mg/L)、BA(0.3mg/L)、2,4-D(0.3mg/L)、NAA(0.lmg/L)和LFS(0.3mg/L)+NAA(0.lmg/L)诱导半夏叶柄体胚发生。其中NAA单独处理效果最佳,其次是LFS单独处理,两者均优于LFS+NAA处理;LFS单独处理与BA单独处理及2,4-D单独处理诱导效果差异不显著;但各处理组诱导效果均优于对照(MS)。
3、以MS为基本培养基,分别添加LFS(0.3mg/L)、BA(0.3mg/L)、2,4-D(0.3mg/L)、NAA(0.1mg/L)和LFS(0.3mg/L)+NAA(0.1mg/L)诱导半夏叶柄体胚的萌发。其中以LFS单独处理诱导效果最好,显著优于其它处理,且再生植株整齐健壮:以NAA单独处理萌发效果最差。
4、以MS为基本培养基,添加LFS(O.3mg/L)诱导半夏体细胞胚胎,黑暗中处理10d再进行常规光照培养的效果最佳,诱导率高,诱导出的体胚健壮,且易于萌发,再生植株整齐健壮。2@5、从MS、MS+LFS(0.3mg/L)对半夏叶柄体细胞胚胎诱导的切片观察发现,体胚多发生于愈伤组织表层或近表层。LFS单独处理与对照(MS)在诱导体胚发生的时间上无明显差异,且在同一愈伤组织块中同时存在不同发育时期的体细胞胚胎。半夏体细胞胚胎发生经历与合子胚类似,它们的结构和关键阶段经历均表现为多细胞原胚、球形胚、鱼雷形胚、盾形胚和成熟胚,最后萌发成完整植株。
6、以MS为基本培养基,分别添加LFS(0.3mg/L)、NAA(0.1mg/L)和LFS(0.3mg/L)+NAA(0.1mg/L)诱导半夏体细胞胚胎。在可溶性蛋白质积累高峰期,LFS单独处理组的可溶性蛋白质含量最高,显著高于其它处理组,即促进了可溶性蛋白质的积累;在可溶性糖积累高峰期,各处理组可溶性糖含量差异不显著,但显著高于对照(MS);在淀粉积累高峰期,各处理组淀粉含量差异不显著,且与对照(MS)无显著差异。
7、以MS为基本培养基,分别添加LFS(0.3mg/L)、NAA(0.1mg/L)和LFS(0.3mg/L)+NAA(0.1mg/L)诱导半夏体细胞胚胎。从抗氧化酶活性上看,SOD、POD和PPO三种抗氧化酶相互配合来调节胚性细胞的分化和发育。酶活性变化与胚性愈伤组织的诱导及胚的发育有着密切关系,表现在体胚的诱导和发育中起到主导作用。SOD、POD和PPO三种酶的活性均于早期胚时期达最大值,三种酶均以LFS单独处理组活性最高,显著高于其它处理组,说明LFS单独处理组提高了SOD、POD和PPO三种酶活性。
8、以MS为基本培养基,分别添加LFS(0.3mg/L)、NAA(0.1mgL)和LFS(0.3mg/L)+NAA(0.1mg/L)诱导半夏体细胞胚胎。从内源激素水平来看,体胚内源IAA、ZR、Gh3和ABA含量均出现了积累峰值,IAA含量峰值出现于早期胚时期,各处理IAA含量差异不显著,但均显著高于对照;ZR含量峰值出现于胚性愈伤组织时期,LFS单独处理ZR含量最高,显著高于对照;NAA单独处理和LFS+NAA处理组ZR含量低于对照;GA3含量峰值出现于早期胚时期,LFS+NAA处理组GA3含量最高,各处理GA3含量均显著高于对照;ABA含量于胚性愈伤组织时期出现一个峰值,LFS单独处理ABA含量最高,NAA单独处理与LFS+NAA处理组次之,均显著高于对照;成熟胚时期再次出现峰值,LFS单独处理以及LFS+NAA处理组含量最高,NAA单独处理对ABA含量的影响与对照差异不显著。
9、综上所述,LFS主要通过以下机制来促进了半夏体胚的诱导,提高了体胚的萌发,体胚胚性愈伤组织时期高水平的可溶性蛋白质含量,为体胚发生提供物质和能量保证;早期胚时期较高的SOD、POD和PPO活性,加快对H202的消除,保持较低水平的H202,从而提高体胚的抗性。IAA含量早期胚时期最高,利于体胚的启动及早期发育;ZR含量和ABA含量于胚性愈伤组织时期较高,利于胚性细胞的分裂和增殖以及体胚的启动;ABA含量于成熟胚时期再次达一峰值,利于体胚的萌发,提高其萌发率。