在代谢工程研究领域中,石杉科植物中的石杉碱甲生物合成与代谢调控的可能途径的建立已然成为该领域的热点。石杉碱甲做为一种强效、低毒且高选择性的中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂,药用价值日益凸显。无论是做为抗老年痴呆症药品,亦或是开发成功能性食品均存在着巨大的市场价值。但由于技术及资源条件的制约,石杉碱甲的获得仍全部依赖于天然石杉科植物全草的提取。因此,了解石杉碱生物合成与代谢可能途径,研究分析这些过程中涉及的关键(酶)基因及其作用的分子机制,对于石杉科植物的有效保护和合理开发利用显得尤为重要。1、石杉碱生物合成途径关键酶基因的扩增体系优化及克隆本论文的目的是建立完善的石杉碱生物合成途径及代谢调控体系。在本实验的研究中,以四种石杉科植物叶片提取的总RNA反转录成的cDNA为模板,应用正交试验,系统的分析了各反应物不同浓度水平对L赖氨酸脱羧酶基因,细胞色素P450,加双氧酶以及甲基转移酶等关键限速酶(基因)PCR扩增结果的影响,并建立了基因扩增优化反应体系。利用基因克隆手段获得并通过比对数据库注释了关键酶基因序列。2、华南马尾杉与有柄马尾杉石杉碱生物合成途径关键酶基因荧光定量Q-PCR分析使用石杉碱甲含量差异较大的华南马尾杉(含量较低)与有柄马尾杉做为试材,通过荧光定量PCR,对比了二者石杉碱生物合成途径中关键酶基因的表达差异。值得注意的是,在华南马尾杉中并未检测到加双氧酶基因的表达,因此假设其编码蛋白质极有可能是石杉碱生物合成途径中一个关键限速酶。另外在有柄马尾杉植体中高表达的基因有L-赖氨酸脱羧酶基因,Cytochrome P450 71A1基因,Cytochrome P450 72A1基因基因。而甲基转移酶基因在两种材料中表达量接近。这些基因编码的蛋白质活跃于石杉碱代谢调控路径中,它们的存在对石杉科植物体内石杉碱含量的积累具有促进作用。3、长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因全长调取及编码蛋白结构分析利用RACE技术获得了长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶共1266 bp基因全长序列,四种碱基的含量分别为：29.5%A；19.4%C；24.4%G；26.7%T；双链的DNA分子大小为780.41 kDa. GOR贝叶斯统计学法分析该序列编码的蛋白质由403个氨基酸组合而成,其中二级结构的存在34.49%的0c-螺旋(Alpha helix)结构,存在19.35%的延伸主链结构(Extended strand),存在46.15%的随机卷曲(Random coil) 。并且使用Swiss-model预测了蛋白质三级结构,与已有的赖氨酸脱羧酶蛋白质序列进行比对,分析了保守区域及可能相关的功能域。4、石杉碱生物合成及代谢调控可能途径描述石杉碱(石杉碱甲)的生物合成可能途径是由L-赖氨酸经过一些列脱羧,脱氨,加氧,脱H2O后形成的△1-哌啶烯,与来源于乙酸的丙二酸单酰辅酶A结合形成的石榴碱和4PAA；二者经过加合后形成石杉碱前提物质马尾杉碱。闭环后的马尾杉碱便是石松定碱骨架,最后再经过一些列的甲基转换及氧化反应最终形成石杉碱甲。总而言之,石杉碱生物合成途径复杂,参与调控的酶种类也繁多。仍有许多不确定的中间体产物的存在,对于代谢途径及关键酶的研究仍有待深入开展,本论文中对所获得的关于4种石杉科植物这些关键酶基因的分析,属国内外石杉碱代谢途径研究内容前沿。为石杉碱代谢工程研究领域的研究提供了重要的指导价值和全新的思路。