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本文为从生理上揭示椰扁甲啮小蜂寄生对椰心叶甲蛹的影响,为给工厂化生产椰扁甲啮小蜂提供更多的技术和理论,对椰扁甲啮小蜂的生物学习性、实验种群生态学及寄生生理生化效应等进行了研究。
以椰扁甲啮小蜂-椰心叶甲蛹的寄生体系为研究对象,对椰扁甲啮小蜂的生物学习性和温度对其寄生作用的影响进行了研究;开展了椰扁甲啮小蜂寄生对寄主椰心叶甲蛹体重和体液的影响、寄生对寄主免疫系统的影响、寄生对寄主血淋巴营养物质含量的影响和寄生对寄主表皮化合物含量的影响等生理生化的研究;采用RT-PCR技术克隆了与寄主免疫相关的酚氧化酶基因;利用双向电泳技术分析寄生蛹与未寄生蛹血淋巴蛋白的差异变化,并选取3个特异蛋白点作质谱分析。主要结果如下:
1、椰扁甲啮小蜂雌雄性比为6.6:1;发育经过卵期2d,幼虫期7d,蛹期10d;补充食料条件下雌蜂平均存活时间6.8d,雄蜂平均存活时间6.0d;选择性寄生条件下,椰扁甲啮小蜂喜寄生蛹期2h~2d的蛹;非选择寄生条件下,椰扁甲啮小蜂对蛹期2h~3d的椰心叶甲蛹有较高的寄生率。
2、26℃是椰扁甲啮小蜂繁殖的最适温度;在20~32℃,椰扁甲啮小蜂雌蜂存活时间随温度升高而缩短;椰扁甲啮小蜂在10℃下贮存10d,能保持较高存活率和寄生能力,贮存经过20d以后则会降低椰扁甲啮小蜂的存活率和寄生能力。
3、椰扁甲啮小蜂的寄生能抑制椰心叶甲蛹的正常生长发育;寄生蛹体液在寄生后4d时明显减少;寄生蛹体液过冷却点和冰点的平均值分别为-8.86℃和0.94℃,比未寄生蛹分别降低了1.46℃和0.11℃。
4、寄生蛹浆血细胞数量和血细胞总量在寄生后0.5~2d较低于同期未寄生蛹,但寄生后3~4d反而较高;寄生蛹浆血细胞延展率在寄生后0.5~3d较低,4d时较高。寄生蛹血淋巴黑化百分率在寄生后0.5~2d较高,寄生后3~4d降低直至为0。寄生蛹血、淋巴酚氧化酶活性在寄生后0.5d、1d和4d较高。寄生蛹血凝素活性在寄生后2d较高,寄生后1d和4d较低。
5、通过RT-PCR,从椰心叶甲蛹总RNA中扩增了三个与酚氧化酶基因相关的DNA片段,并成功克隆;经测序得到三个片段的碱基序列,分子量分别为417bp、638bp和1206bp。经同源性比对,417bp和638bp片段与黄粉甲原酚氧化酶同属一类;417bp和638bp的cDNA序列比对表明,638bp片段内包含了417bp片段的全序列,同时还存在两个插入序列,这两个插入序列基本都处于编码酚氧化酶氨基酸序列的阅读框之外。
6、寄生蛹血淋巴可溶性蛋白含量在寄生后4d比同期未寄生蛹显著降低,血淋巴总糖含量和还原糖含量在寄生后0.5~4d变化不明显,血淋巴海藻糖含量在寄生后1d和2d时显著降低;寄生使寄主蛹血淋巴中赖氨酸、精氨酸和丙氨酸的含量显著升高,并能引起不常见氨基酸EOHNH<,2>、PEA和NH<,3>含量的显著变化。
血淋巴蛋白SDS-PAGE电泳结果表明:寄生后4d,寄生蛹血淋巴蛋白组分缺失了一条分子量为54kD的蛋白带,新出现了一条分子量为62kD的蛋白带。
7、寄生蛹表皮水溶性蛋白在寄生后3d和4d显著高于同期未寄生蛹,表皮结合蛋白的含量在寄生后1d显著低于对照,寄生蛹表皮脂类含量在寄生后1-2d显著高于对照;寄生蛹表皮中检测到60种碳氢化合物,其中有18种为特异的碳氢化合物,包括烃类10种,醇类4种,酯类2种,杂环类2种。
8、通过双向电泳技术,得到相应的蛋白质双向电泳图谱。寄生后0.5-2d,寄生蛹血淋巴蛋白斑点数量比同期未寄生蛹多,寄生后3-4d则较少;寄生蛹特异蛋白点在寄生后1d、2d和4d以分子量30-60kD的蛋白点较多;寄生蛹特异蛋白点在寄生后0.5d、1d和4d以碱性蛋白点较多;寄生蛹在寄生后2d比同期未寄生蛹有较多高丰度蛋白的表达,在0.5d、1d、3d和4d则较少。
选取电泳图谱中三个特异蛋白点进行MALTI-TOF串联质谱分析和NCBI蛋白库的比对,来自0.5日龄未寄生蛹的特异点,蛋白序列与精原特异乙酰辅酶A转运蛋白相似率为94%,故推测其为精原特异乙酰辅酶A转运蛋白;来自4日龄未寄生蛹的特异点,蛋白序列与一种未定名的多功能蛋白相似率最高,故推测其为这种未定名的多功能蛋白;来自4日龄未寄生蛹的另一个特异点,蛋白序列与一种未定性的蛋白相似率最高,故推测其为这种未定性的蛋白。