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目的:1.体外实验观察吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2,人肝癌细胞株MHCC97H和人肝癌细胞株MHCC97L增殖能力的影响,并选取两个细胞株进一步研究吴茱萸碱对增殖、凋亡相关表型和蛋白的影响,探讨吴茱萸碱抗肿瘤增殖、凋亡的相互作用机制。2.体内实验建立HepG2肝癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型,观察吴茱萸碱对肝癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤的影响,通过体内实验进一步验证吴茱萸碱对肿瘤增殖、凋亡的影响及相互作用机制。方法:1.采用吴茱萸碱浓度为 5 μ mol/mL,2.5 μ mol/mL,1.25 μ mol/mL,0.625 μmol/mL,0.3125 μ mol/mL,0.15625 μ mol/mL 和 0 μ mol/mL 作用于人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H和HMHCC97L 24和48小时,MTT法检测吴茱萸碱对三种细胞增殖能力的影响。随后选取人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H做后续实验。本文采用平板克隆形成实验检测吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H长期增殖抑制的影响。给药观察吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H形态学的影响。Hoechst 33342染色法检测吴茱萸碱对人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H凋亡影响。为了进一步验证吴茱萸碱与人肝癌细胞株HepG2、MHCC97H与凋亡的相关性,本文采用流式细胞术检测吴茱萸碱对人肝癌细胞凋亡的影响,同时为了验证吴茱萸碱与人肝癌细胞株HepG2和MHCC97H增殖相关,本文采用流式细胞术检测吴茱萸碱对人肝癌细胞周期的影响。采用Western-blot法检测吴茱萸碱对细胞中Cleaved caspase3,Cleaved parp,Parp,P-erk,Erk,P-p38,P38,Bel-2,CyclinB1 和 P53 蛋白表达水平的影响。为了进一步研究吴茱萸碱对人肝癌细胞相互作用机制,本文选取人肝癌细胞株MHCC97H来探讨,根据前面的实验,本文采用Erk抑制剂U0126和P38小分子干扰RNA(Si p38 RNA)来探讨其相关作用机制,用MTT法和WB选取合适的U0126和Si p38 RNA浓度,采用Western-blot检测吴茱萸碱+U0126或者Si P38 RNA对细胞中Cleaved parp,Parp,P-erk,Erk,P-p38和P38蛋白表达水平的影响。2.将HepG2细胞接种于裸鼠右侧肋腰部皮下,建立肝癌裸鼠皮下荷瘤模型,建模成功后根据肿瘤体积随机分为三组:空白组、索拉非尼组、吴茱萸碱组,分别给予0.5%羧基纤维素纳溶液、索拉非尼(30mg/kg/d)、吴茱萸碱(30mg/kg/d)口服灌胃,每隔三天称量裸鼠体重和测量瘤体的大小,实验结束后,处死裸鼠取出皮下瘤,称量皮下瘤重量,观察各组肿瘤重量的变化,Western-blot法检测吴茱萸碱对肿瘤组织中 Cleaved parp,Parp,P-erk,Erk,P-p38,P38 和 CyclinB1 蛋白表达水平的影响,免疫组化检查吴茱萸碱对肿瘤组织中的Cleaved parp,P-erk和P-p38相关蛋白定位或定量的研究。结果:1.(1)MTT结果显示:在48h药物浓度为1.25 μmol/ml时,吴茱萸碱能显著性地抑制肝癌细胞的增殖,与空白组比较具有显著性差异(F=58.278,P=0.000;F=37.523,P=0.000;F=45.824,P=0.000),尤其是HepG2 和 MHCC97H,随着时间和剂量的增加而变化明显。其中HepG2,MHCC97H和MHCC97L 48H的IC5。分别为1.49 μ mol/ml,0.96 μ mol/ml,3.27 μ mol/ml。(2)平板克隆形成实验显示:吴茱萸碱能明显的抑制HepG2和MHCC97H细胞的长期增殖,在药物浓度为1.25 μ mol/ml时,吴茱萸碱能显著性地抑制肝癌细胞的增殖,与空白组比较具有显著性差异(F=21.686,P=0.028;F=113.869,P=0.000)。(3)在药物干预48h后,和空白组相比,药物组细胞的形态发生了明显的变化,由原来梭型、不规则形态、成团贴壁生长的细胞而逐渐皱缩、变形、细胞体积变小、细胞间的距离明显变大,且这种形态学的变化随着药物剂量的增加而更明显。(4)Hoechst 33342染色法显示:与空白组相比,随着剂量的增加,药物组发生显著的凋亡形态改变,出现明显的凋亡特征:核固缩、凋亡小体、膜空泡等,细胞核呈现碎片状,并且细胞核呈致密亮蓝色浓染。(5)流式细胞术显示:随着药物剂量的增加,药物组凋亡显著增加,在药物浓度为1.25 μ mol/ml时,吴茱萸碱能显著性地抑制人肝癌细胞的增殖,与空白组比较具有显著性差异(F=364.535,P=0.000;P=0.031)。其中HepG2细胞各浓度的平均凋亡率分别为:3.13%、9.50%、22.20%、32.60%,MHCC97H细胞各浓度的平均凋亡率分别为:7.33%、42.57%、56.20%、58.97%。其中在MHCC97H细胞凋亡表现的特别明显,在1.25 μ mol/ml时候凋亡明显增加,随着剂量的增加变化不是特别明显。而HepG2细胞随着剂量的增加凋亡增加的特别明显。(6)流式细胞术显示:随着药物剂量的增加G0/G1期和S期下降,HepG2的G0/G1期从62.84%至36.33%,S期从 27.93%至 0.00%,MHCC97H 的 G0/G1 期从 50.29%至 39.62,S 期从 33.26%至12.90%,而G2/M明显上升,HepG2的G2/M期从9.22%至 63.67%,971H的G2/M期从16.44%至47.48%。(7)Western-blot结果显示:吴茱萸碱能明显地上调人肝癌细胞株 HepG2 中的 Cleaved caspase3、Cleaved parp、P-erk、P-p38、CyclinB1、P53蛋白的表达,与空白组比较具有统计学意义(F=3.071,P=0.041;F=14.768,P=0.001;P=0.038;F=13.452,P=0.002;F=2.078,P=0.044;F=3.336,P=0.037);能显著地降低抑制凋亡蛋白Bel-2的表达水平,与空白组比较具有统计学意义(F=6.978,P=0.013);而对Parp、Erk和P38蛋白无明显地影响,与空白组比较不具有统计学意义(F=0.722,P=0.567;P=0.091;F=0.051,P=0.981);吴茱萸碱能明显地上调人肝癌细胞株MHCC97H中的Cleaved caspase3、Cleaved parp、P-erk、P-p38、CyclinB1、P53蛋白的表达,与空白组比较具有统计学意义(P=0.027;F=15.791,P=0.001;F=2.905,P=0.043;F=2.902,P=0.043;F=6.641,P=0.015;F=4.803,P=0.034);能显著地降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,与空白组比较具有统计学意义(F=3.079,P=0.042);而对Parp,Erk和P38蛋白无明显地影响,与空白组比较不具有统计学意义(FF=0.031,P=0.991;F=0.255,P=0.856;F=0.020,P=0.996)。运用Erk抑制剂U0126和P38小分子干扰RNA结果表明吴茱萸碱联合U0126或者Si p38 RNA使促进凋亡Cleaved parp蛋白表达降低,与吴茱萸碱组比较具有显著性差异(F=25.568,P=0.000;F=327.293,P=0.000)。2.HepG2细胞荷瘤裸鼠模型实验结果显示:吴茱萸碱剂量组荷瘤裸鼠体重明显增加,与空白组比较有显著性差别(F=8.672,P=0.039);吴茱萸碱剂量组和索拉非尼剂量组裸鼠的皮下瘤体重明显地缩小,与空白组比较有显著性差别(F=28.114,P=0.043;F=28.114,P=0.000);吴茱萸碱能上调肿瘤组织中 Cleaved parp,P-erk,P-p38和CyclinB1的蛋白表达,与空白组比较有显著性差别(F=51.030,P=0.000;F=4.259,P=0.042;F=16.792,P=0.001;F=23.076,P=0.001),而对Parp、Erk和P38蛋白无明显地影响,与空白组比较不具有统计学意义(F=0.097,P=0.752;F=0.439,P=0.941;F=0.537,P=0.605);索拉非尼能上调肿瘤组织中Cleaved part,P-p38和CyclinB1蛋白表达,与空白组比较有显著性差别(F=51.030,P=0.000;F=16.792,P=0.016;F=23.076,P=0.001),而对Parp,Erk和P38蛋白无明显地影响,与空白组比较不具有统计学意义(F=0.097,P=0.691;F=0.439,P=0.470;F=0.537,P=0.641)。结论:1.吴茱萸碱能够明显地抑制肝癌细胞的增殖。MTT实验和平板克隆实验结果说明吴茱萸碱能对肝癌细胞增殖产生短期或者长期地抑制作用;进一步采用流式细胞术实验说明吴茱萸能明显地将肝癌细胞阻滞在G2/M期;并且WB结果表明吴茱萸碱能明显地上调与G2/M期密切相关的CyclinB1周期蛋白表达。2.吴茱萸碱能够促使肝癌细胞产生凋亡。MTT实验、形态学观察和Hoechst 33342染色法结果说明吴茱萸碱可能通过凋亡促使肝癌细胞死亡;进一步用流式细胞术实验证明了吴茱萸碱能使肝癌细胞产生凋亡;并且WB结果表明吴茱萸碱能明显地上调肝癌细胞中促进凋亡Cleaved caspase3和Cleaved parp蛋白表达水平;同时也能下调抑制凋亡Bcl-2蛋白表达水平。3.吴茱萸碱和索拉非尼都能通过MAPK通路使得肝癌细胞产生凋亡起到治疗肿瘤的作用,但具体作用机制不同。体内和体外实验结果表明吴茱萸碱主要是通过激活MAPK通路中的P-erk和P-p38,上调促进凋亡Cleaved parp蛋白表达,促使肝癌细胞产生凋亡;而体内试验表明索拉非尼主要是通过激活MAPK中的P-p38,上调促进凋亡Cleaved parp蛋白表达,促使肝癌细胞产生凋亡。4.吴茱萸碱抗肿瘤作用是多靶点、多途径共同作用的结果;其能从多个方面对肿瘤产生影响,从而起到抗肿瘤的作用。