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肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多因素调控、多阶段逐步演变的错综复杂的过程。导致细胞增殖与分化异常、促进细胞恶变为癌的根本原因就是某些基因结构的变异或表达的失控。近年来与肿瘤发生发展相关的分子事件日益受到重视：癌基因激活，抑癌基因失活，细胞内信号传导通路、细胞周期和细胞凋亡途径受到异常调控，等等。其中肝细胞生长因子／扩散因子(hepatocyte growth factor／scatter factor，HGF／SF)和Met受体结合后启动的细胞内酪氨酸激酶信号传导通路在肿瘤的浸润生长中起着非常重要的作用，HGF／SF促进细胞分裂、运动、形态发生，它和Met受体的异常表达被认为是肿瘤恶性标志之一。 肝细胞生长因子激活因子的抑制因子1(hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1，HAI-1)于1997年首次被发现，是一种Kunitz型的丝氨酸蛋白酶抑制因子。HAI-1可特异地抑制肝细胞生长因子激活因子(hepatocyte growth factor activator，HGFA)和新近发现的SNC19／matriptase。这两种丝氨酸蛋白酶都是HGF／SF的激活因子，HGF／SF的单链前体被激活为有活性的双链异二聚体后才能介导细胞内信号传导。SNC19／matriptase除了激活HGF／SF，还可以降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，激活尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，促进细胞运动和上皮迁移。虽然有文献根据HAI-1和SNC19／matriptase在部分肠癌和卵巢癌中的表达提出了它们可能与肿瘤的发生、进展、转移有关的假设，但由于例数较少，无法得出较为可靠的结论。 HAI-1具有两个特征性的Kunitz功能域，都可对丝氨酸蛋白酶产生抑制作用。HAI-1已知的作用底物有HGFA、SNC19／matriptase、纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶。但两个Kunitz功能域的抑制作用并不能叠加，而且可能有不同的作用特性，空间构象的改变使HAI-1和底物蛋白的亲和力发生变化。此外，HAI-1的Kunitz功能域是否存在其他可能与肿瘤发生发展相关的底物蛋白及其相关机制都有待于进一步研究。浙江大学硕士研究生毕业论文 本课题从分析HAI一1和sNclg/matriPtase与肿瘤的可能联系着手，对两者在胃肠肿瘤及癌旁正常组织的表达进行了研究。另外还分段克隆了HAI一l的功能域并在大肠杆菌中表达，为进一步研究HAI一1的生物学功能打下了基础。1 .HAI一1、sN引9/nlat:iptase在胃肠肿瘤及癌旁正常组织中的表达 用逆转录一实时荧光定量PCR技术，检测HAI一l、sNcl 9/matriPtase在胃肠肿瘤及相应的癌旁正常组织中的表达，分析两个指标及两者之间的比值改变与各临床病理指标(临床分期、有无淋巴结转移、分化程度)的关系。结果表明: 在胃癌组织中，HAI一l和sNc 1 9/matriptase的表达水平明显低于癌旁正常组织中的水平(Z=一3.280，介0.006;z=一4.651，介0.000)，HAI一1:SNC19/matriPtase则无差异(外0.05)。111/W期胃癌组织中HAI一l的表达水平和HAI一l:SNC!9/matriptase低于工/II期胃癌组织 (Z=一2.!40，介0.0引;Z=一2.155，介0.031)，有淋巴结转移的胃癌组织低于无淋巴结转移的胃癌组织(于一2.051，片0.036;Z=一2.656，介0.006)，而sNC19/matriPtase表达水平则无差异(介0.05)。HAI一l表达水平和HAI一1:sNe一9/matriptase随着胃癌分化程度增高而增加，但尚无统计学意义(几0.05)，SNCI 9/matriPtase在不同分化程度胃癌组织中的表达水平亦无差异 (尸卜0 .05)。 在大肠癌组织中，HAI一l和SNC!9/matriPtase的表达也显著低于相应的癌旁正常组织 (z=一3一00，作0.002:于一2.73一，片0.006)，日AI一l:sNe一9/matriptase无差异(几0.05)。日Al一随着大肠癌浸润深度增加而表达降低，但尚无统计学意义(P>0.05)。sNclg/matriPtase及HAI一l:SNC19/matriPtase在不同临床分期大肠癌组织中的表达也无差异(羚0.05)。随着淋巴结转移的发生，三个指标均无差异表现(介0.05)，在不同分化程度大肠癌组织中的表达也无差异 (尸卜0 .05)。2.HAI一1不同功能域的原核表达载体构建及表达 针对HA!一l的不同功能域设计相应的5对引物，分别扩增KOI、KOI+LDLR、KOZ、LDLR+KDZ、Kol+LoLR+KoZ片段。用含有全长HAI一1 eoNA的质粒PeoNA3.l/HAx一为模板进行PcR扩增，并将PcR产物克隆至pGEM一T Easy载体，ONA序列测定验证其准确性。分别用Nd几I/Sael和Ndel/BamHI双酶切将5个片段克隆至原核表达载体plVEx2.3一MCs，并经酶切鉴定。将上述表达不同功能域的载体转化至大肠杆菌Ecoli BLZI(0E3)菌株，培养后用IPTG诱导融合蛋白表达，以westem blot鉴定，并进一步用镍亲和层析柱纯化His一Tag标记的KDI+LDLR+KDZ融合蛋白。浙江大学硕士研究生毕业论文 通过上述研究，得到以下结论:!.HAI一l及SNC19/matriPtase在胃肠道肿瘤组织中的表达都低于相应的癌旁正常组织，日A一1:sNe 19/matriptase则无差异;2.在胃癌组织中，随着浸润深度的增加和淋巴结转移的发生，HAI一1的表达及HAI一l:sNC 19/matriptase降低，sNe 19/matriptase的表达无差异;HAI一!、SNC19/matriptase的表