背景知识:痘病毒科(Poxiridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus，CPV)病毒主要包括山羊痘病毒(Goatpox Virus，GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox Virus，SPPV)和疙瘩皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus, LSDV）三种。GTPV、SPPV引起的羊痘(Capripox)又名羊“天花”，是羊的一种急性、热性、接触性传染病，包括绵羊痘(Sheeppox，SP)和山羊痘(Goatpox，GP)。主要表现为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生红斑、丘疹、疱疹、水泡(少数)，内脏病变(特别是肺)。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，发病后成羊死亡率40％，羔羊死亡率100％，有本病的国家和地区的易感动物及其相关产品被世界各国列为严格限制进出的对象，对国际贸易和养羊业的发展产生着严重的影响。根据流行病学和临床症状，中国、瑞典、印度等国家都有关于人类感染羊痘病毒的报道。因此，在公共卫生方面，对山羊痘及绵羊痘的研究也有非常重要的意义。此外，羊痘病毒还可作为生物武器，恐怖分子可利用其作为威胁世界和平的手段，现羊痘病毒已被划归为Ⅱ类危险战剂。世界动物卫生组织(OIE)将该羊痘病定为法定通报疾病，我国也将其列为Ⅰ类动物疫病。GTPV和SPPV基因组约有150kb，共有147个开放阅读框(Open reading frame，ORF)。疙瘩皮肤病病毒（LSDV）引起疙瘩皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，又称结节性皮炎或块状皮肤病，是一类传染性疾病，该病主要感染牛，患牛的主要症状是发热，皮肤水肿，淋巴结肿大，皮肤、器官表面、黏膜等处有结节状突起。该病能引起被感染动物轻者食欲不振、消瘦、产乳量大幅度降低，重者导致死亡。虽然LSD起源于非洲，但是根据20世纪80年代末及21世纪初期在以色列该病的爆发流行情况可以看出其已有向世界上其他地方不断扩散的趋势。各种牛均易感染LSD，死亡率能达到3%～85%，给经济带来较大的损失。2001年美国科学家报道了LSDV的基因组序列，其基因组长145kb～152kb，基因组中没有发卡环结构，核苷酸组成中含有73%A+T，呈有规律的均匀分布。三种病毒基因间的同源性非常高，如要对三种病毒进行基因水平的检测，必须找到针对三种病毒的特异性基因序列。但是，目前世界各国都还未有较为可靠的检测该属病毒的方法，使进出口检验检疫处于被动地位。为严防该类病的传入，减少损失，建立快速高效，操作简便，成本低廉的CPV检测方法迫在眉睫。工作目的:本课题拟在对CPV进行以下研究：分析病毒的特征基因，针对高度保守序列，设计引物及特异性探针，进行试验研究；建立一种检测CPV，GTPV、SPPV及LSDV的寡核苷酸微阵列检测方法。研究方法:建立CPV的基因芯片检测技术，主要包括以下几个方面：①目的基因序列分析及PCR引物设计：对GenBank上公布的GTPV、SPPV及LSDV各个ORF的基因序列进行比对后发现，ORF132基因相对于其他ORF有较大的特异性，可作为目的基因建立分子生物学检测方法，设计PCR引物；②引物验证及PCR重要参数的优化：通过病毒增殖，对目的基因进行克隆分析，包括质粒模板的准备、引物的验证、退火温度的优化、循环数的优化等；③目的基因片段的基因芯片探针的设计：对PCR产物进行连接、转化，提取质粒测序，根据扩增片段设计、合成基因芯片探针；④制备基因芯片：采用基因芯片微量点样技术，将检测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，样品经下游引物用Cy3标记的引物进行PCR扩增后，与芯片在杂交水浴锅内杂交，最后进行扫描分析杂交结果；⑤SPPV、GTPV及LSDV的基因芯片检测方法的优化：筛选特异性探针，杂交温度、杂交反应时间的优化；⑥方法学验证：研究基因芯片检测方法的重复性、灵敏度、稳定性等相关参数的验证。成果和结论:结果显示，各条筛选探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定；本研究建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障。该研究为建立一整套该属病毒的分子诊断技术平台，对满足进出境动物检疫工作的需要，控制GSP传播，并防止LSD由境外向我国扩散，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。