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目的:1.研究高毒力肺炎克雷伯菌毒力、耐药特征及流行病学特征2.研究高毒力肺炎克雷伯菌毒力及耐药质粒的流行和进化特征方法:1、收集2016年至2020年从南昌某公立医院各种临床标本分离出的肺炎克雷伯菌,采用环介导等温扩增技术筛选出50株高毒力肺炎克雷伯菌,采用Vitek2-Compact全自动细菌鉴定仪进行细菌鉴定和药敏分析。通过该医院的病历系统查询临床资料,使用大蜡螟幼虫感染模型,血清抗性实验,生物被膜形成实验,拉丝实验等分析高毒力肺炎克雷伯菌的毒力特征。对50株高毒力肺炎克雷伯菌菌株进行全基因组测序,依托Res Finder、Virulence Factor Database和Pasmid Finder等数据库,利用Kleborate Tool等工具,分析高毒力肺炎克雷伯菌的耐药基因谱及碳青霉烯类耐药机制;毒力基因谱及评估毒力潜力;分析质粒复制子分型;应用基于基因组SNP差异构建进化树分析其亲缘关系。2、从第一部分选取34株高毒力肺炎克雷伯菌应用第二代测序与第三代测序技术相结合的方式,绘制高毒力肺炎克雷伯菌的精细基因组图谱,明确高毒力肺炎克雷伯菌中毒力及耐药质粒在近五年内的流行和进化情况。结果:1.（1）50例感染高毒力肺炎克雷伯菌的病人年龄差距较大,主要集中在30-69岁年龄组,男性（38例,76%）患者数量略多于女性。80%以上感染高毒力肺炎克雷伯菌分离自重症监护病房患者或者有过重症监护病房的经历的患者。（2）50株hv KP菌株共检出7种荚膜血清型,分别为K1、K2、K5、K20、K57、K47和K64,构成比分别为18%（9/50）、18%（9/50）、6%（3/50）、2%（1/50）、4%（2/50）、2%（1/50）、50%（25/50）。检测到十余种不同ST分型,其中主要为ST11（26/50,52%）、ST23（8/50,16%）、ST65（4/50,8%）,且ST分型和荚膜血清分型存在对应关系。（3）共检出CR-hv KP菌株36株,占比72%,主要为K64-ST11型CR-hv KP,并且除了少数几种抗生素外,对其他抗生素耐药基本耐药。其余14株高毒力肺炎克雷伯菌表现出对所有常见抗生素敏感。对碳青霉烯类耐药机制主要为携带bla KPC,发现有共携带bla NDM的菌株,且全部碳青霉烯耐药基因均由质粒携带。发现所有hv KP菌株同时携带超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum betalactamase,ESBLs）基因,携带ESBLs的基因类型包括CTX-M、SHV或TEM型,大部分菌株携带2-3种β-内酰胺酶基因。发现有不携带碳青霉烯酶基因介导的耐药机制,占比22%,主要为携带超广谱β-内酰胺酶基因合并外膜蛋白基因缺失突变导致,主要为ST23型。（4）高毒力肺炎克雷伯菌的荚膜产生能力、血清抗性水平、生物膜形成能力和大蜡螟幼虫致死能力各异,高毒力肺炎克雷伯菌内部毒力水平存在异质性。（5）利用Kleborate Tool对菌株进行毒力分析,发现毒力得分92%为高毒力,8%为中等毒力,未发现低毒力。本研究按照5种关键毒力基因不同组合,分出七种毒力基因谱,发现ST11 CR-hv KP中高度流行的rmp A+rmp A2+iuc A+iut A组合,以及ST23 hv KP中主要流行的rmp A+rmp A2+iuc A+iut A+iro B毒力基因谱。在hv KP中共检出11种不同类型的质粒复制子,大部分菌株中超过3种类型的质粒复制子,最多包含7种,表明这些菌株携带多个质粒,并且这些质粒多为毒力质粒和耐药质粒。基于SNP的进化树显示,MLST类型一致的菌株大部分聚集在一起。2.二代联合三代测序表明耐药基因和关键毒力基因分别定位在耐药质粒和毒力质粒上。毒力质粒系统发育分析发现大部分质粒同源性较高,同时,我们也能发现其存在遗传多样性。研究发现在整个调查期间,衍生出多种毒力基因组合、质粒复制子类型表现出多样性,菌株宿主范围不断增宽,呈现发散式的进化。Inc HI1B/Inc FIB型毒力质粒仍占据主导地位。CR-hv KP中耐药质粒包含多种抗生素相关耐药基因,分析bla KPC周围基因结构,CR-hv KP菌株中bla KPC基因的周围基因环境可以分为五种不同的non-Tn4401 elements（NTEKPC）模式,耐药质粒也存在多态性。3.该院早在2017年就发生了毒力和耐药质粒融合现象,产生了融合质粒,其中梁个是以Inc HI1B/Inc FIB型质粒为主体,bla KPC成功整合到其中,有一个是以Inc FII/Inc R型质粒为主体,iuc ABCD,iut A,rmp A,rmp A2毒力基因簇成功整合到其中。结论:1.该院流行hv KP感染主要来源ICU,以ST11、ST65/ST86型为主,多携带毒力质粒和耐药质粒。2.hv KP具有较强获取ESBLs耐药基因能力,CR-hv K碳青霉烯类耐药机制以携带bla KPC-2为主,存在部分不携带碳青霉烯酶基因,主要是外膜蛋白基因缺失突变联合携带ESBLs基因介导的耐药机制。3.hv KP菌株整体毒力较高,但是毒力水平存在异质性。4.毒力质粒在hv KP中呈现发散式多态性进化,在2016年至2020年多态性进展比较明显,但是Inc HI1B/Inc FIB型质粒仍占据主导地位。5.耐药质粒在CR-hv KP中表现多态性以KPC基因环境变化为主,也存在一定的遗传多样性,而其中的毒力质粒表现较均一,未呈现明显多态性。