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核糖体作为一种核糖核蛋白复合物是自然界所有细胞中将m RNA翻译成蛋白质的细胞机器。核糖体的生物发生过程在真核细胞中非常复杂,参与核糖体组装过程的200多个组装因子和几种耗能的酶与组装的核糖体瞬时缔合,以促进r RNA的加工和折叠以及核糖体蛋白的结合,从而促进具有翻译能力的核糖体亚基的产生。18S r RNA 3’末端的切割是核糖体小亚基成熟过程中的最后事件之一,它会生成成熟的具有翻译功能的小核糖体亚基,参与该过程的非核糖体蛋白-RIOK-1(Right Open Reading Frame 1 protein kinase)和RIOK-2(Right Open Reading Frame 2 protein kinase)蛋白激酶的缺失均可引起核糖体成熟过程的紊乱,是40S pre-r RNA成熟所必需的蛋白激酶。除此之外,RIOK-1和RIOK-2可以驱动细胞增殖和存活,并且他们的表达与致癌性AKT信号有关。在核糖体小亚基成熟过程中发挥关键作用的另外一个加工因子-DIM1(Dimethyladenosine transferase 1)是RIOK-2蛋白激酶的底物,其是合成核糖体小亚基18S r RNA的前加工反应所必需的,DIM1通过对r RNA进行甲基化修饰从而促进核糖体的成熟。尽管已在酵母和哺乳动物细胞中详细阐明了RIOK-1,RIOK-2和DIM1的功能,但对其在寄生虫中的作用知之甚少。在本研究中,使用显微注射转基因技术和关键氨基酸突变技术对RIOK-1,RIOK-2和DIM1在寄生线虫中的功能进行了探索。结果显示:1)粪类圆线虫(Stongyloides stercoralis)RIOK-1蛋白激酶调控幼虫的生长发育通过转基因技术确定的定位在粪类圆线虫幼虫神经细胞内的Ss-RIOK-1(粪类圆线虫RIOK-1蛋白激酶)含有保守的催化结构域,在体内表达因为催化结构域内282位天冬氨酸突变而引起的在体外丧失激酶磷酸化活性的Ss-RIOK-1可强烈抑制粪类圆线虫转基因幼虫的发育,并最终导致幼虫在自由生活的第一阶段幼虫(PFL L1)到第二阶段幼虫(PFL L2)的发育过程中死亡。通过在体内共表达野生型和突变型的Ss-RIOK-1可有效救援D282A突变表型。我们的发现表明,Ss-RIOK-1对于粪类圆线虫自由生活幼虫的发育和存活是必不可少的,并且其催化活性对其在寄生线虫中的功能至关重要。2)粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶调控幼虫的生长发育和虫卵的孵化Ss-RIOK-2(粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶)主要在转基因幼虫的肠道和皮下细胞的细胞质中表达,不仅如此,在转基因的胚胎中Ss-RIOK-2同样是表达在细胞质中。Ss-RIOK-2在幼虫中的表达随着幼虫从PFL L1到感染性第三阶段幼虫(i L3)的生长发育而发生改变,即在皮下组织中表达Ss-RIOK-2的幼虫数量增加,而在肠道组织中表达Ss-RIOK-2的幼虫数量减少。催化域内保守的228位天冬氨酸的突变导致Ss-RIOK-2在体外的激酶活性显著降低,并且体内表达激酶活性部分丧失的Ss-RIOK-2引起幼虫的生长和发育出现明显的延迟。有趣的是,ATP结合域内保守的123位赖氨酸突变的Ss-RIOK-2的表达可导致转基因虫卵的孵化缺陷,并且引起定位在虫卵细胞的细胞质中的Ss-RIOK-2异常定位在细胞核中。通过在体内共表达野生型和ATP结合关键氨基酸突变的Ss-RIOK-2可有效的救援虫卵孵化障碍,并且使Ss-RIOK-2恢复其细胞质定位。我们的研究结果表明,Ss-RIOK-2的ATP结合能力而不是其催化活性对于粪类圆线虫的虫卵孵化至关重要。3)粪类圆线虫DIM1编码基因的鉴定及其在幼虫中表达谱的研究本研究通过NCBI数据库和Wormbase数据库获得粪类圆线虫Ss-dim-1基因的c DNA序列,其中编码区长度为915bp,共编码304个氨基酸。通过氨基酸比对发现Ss-DIM1(粪类圆线虫二甲基腺苷转移酶1)具有保守的功能结构域。通过转录组数据分析,Ss-dim-1基因在粪类圆线虫生长发育的各个时期均有转录,且在体内发育阶段和成虫阶段具有较高的转录水平。体外磷酸化实验表明Ss-DIM1可显著被Ss-RIOK-2蛋白激酶磷酸化。应用在线软件预测的Ss-dim-1基因的启动子序列全长1602bp,转基因实验表明Ss-dim-1基因启动子可以驱动gfp基因主要表达在幼虫身体中部的生殖原基。本研究在粪类圆线虫中对RIOK-1和RIOK-2蛋白激酶进行功能研究,对其在粪类圆线虫幼虫的生长发育和虫卵的孵化过程中的功能进行探索;其次,对粪类圆线虫DIM1甲基转移酶进行了分离鉴定,并对其在幼虫中的表达谱进行检测,旨在阐述三个核糖体小亚基成熟关键因子在粪类圆线虫生长发育等过程中的功能,为深入探讨粪类圆线虫中核糖体加工因子的分子机制提供依据,并为开发新型抗寄生线虫病的药物奠定理论基础。