研究背景随着微生物组学和代谢组学技术的发展,微生物组学和代谢组学研究越来越深入。人体微生物包括了口腔微生物群、肠道微生物群、阴道微生物群等。其中,肠道微生物群(主要是肠道菌群)及其代谢产物与人体疾病相关性研究己成为近年微生物学研究的热点。截止至目前,肠道菌群己被认为在多种疾病(包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝以及心脑血管疾病等)的发生发展中起着重要的作用。而以动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)为基础病变的多种疾病,包括脑卒中和冠心病,依然是我国疾病防治的重点和难点。我国每年有150万～200万新发脑卒中的病例,校正年龄后的年脑卒中发病率为(116～219)/10万人口,年脑卒中死亡率为(58-142)/10万人口。我国现存脑血管病患者700余万人,其中约70%为的缺血性脑卒中。而缺血性脑卒中的病因主要为AS。根据TOAST分型(Trial of Org 10172 Acute Stroke Treatment,一种国际上使用最为广泛的缺血性脑卒中病因学分型方法)我们可以将缺血性脑卒中分为5种亚型：大动脉粥样硬化性(large -artery atherosclerosis, LAA)、心源性栓塞(cardioembolism,CE)、小动脉闭塞性(small-artery occlusion lacunar, SAA)、其他病因(stroke of other demonstratedetiology, SOE)和病因不明(stroke of otherundemonstrated etiology, SUE)。王拥军教授团队曾对天坛医院300名首发缺血性脑卒中患者进行TOAST分型,结果大动脉粥样硬化性脑卒中(LAA)占40%,明显高于其它4型。除此之外,LAA不但发病率高,其死亡率也较其它亚型高。以南京卒中登记研究为例,该研究最终共纳入了752例首次发生卒中的患者,其中71%为缺血性脑卒中,统计一年累计死亡率为13.6%；各类卒中死亡率各不相同,小动脉卒中的死亡率约为7.3%为最低,而LAA死亡率高达15.8%,为死亡率最高的卒中类型。2011年,来自美国克利夫兰医学中心由Hazen教授带领的一个研究团队,首先报道了肠道菌群可通过其代谢产物氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide, TMAO)参与AS的发生发展,从而促使心脑血管疾病(主要是以AS为基础的心脑血管疾病,如动脉粥样硬化性脑卒中、冠心病等)的发生。该途径相比于肠道菌群通过影响肥胖、高血压和糖尿病等心脑血管疾病高危因素间接促进心脑血管疾病的发生发展要来得更加直接。该团队发现,来自日常饮食中的磷脂酰胆碱和左旋肉碱进入肠道后在肠道菌群的作用下可代谢为三甲胺(Trimethylamine, TMA); TMA可在肠道吸收入血,然后在肝脏黄素单加氧酶(Flavin-containing Monooxygenase 3, FMO3)的作用下氧化为TMAO, TMAO可进一步通过促进巨噬细胞转化为泡沫细胞等途径促进AS的发生发展,进而导致心脑血管疾病发生。另外,TMAO业已被多项研究证明,其血浆浓度升高与心衰、慢性肾脏疾病等的远期不良预后相关,血浆高水平的TMAO往往预示着预后不良。除了TMAO途径,2012年发表于Nature Com的一项宏基因组学研究表明,症状性AS与肠道菌群改变相关；该研究发现症状性AS患者(患者罹患小卒中、短暂性脑缺血发作/TIA或视网膜动脉闭塞,影像学证实存在颅内外斑块)与正常对照相比,其肠道菌群有益菌(如柔嫩梭菌)含量减少,而有害菌(如Collinsella)含量增高,且菌群编码肽聚糖等有害物质的基因表达增多。上述研究表明,肠道菌群及其代谢产物TMAO是动脉粥样硬化性疾病潜在的一个新的预防和治疗靶点。然而,迄今为止,国内还罕见关于大动脉粥样硬化性缺血性脑卒中／短暂性脑缺血发作(LAA/TIA)患者肠道菌群及血浆TMAO水平改变的研究。研究目的和意义为了研究LAA/TIA与肠道菌群及血浆TMAO水平间的相关关系,我们建立了一个病例对照研究。本研究拟分析LAA/TIA患者肠道菌群改变情况,初步了解肠道菌群与卒中事件的相关性；比较卒中患者与正常对照的血浆TMAO水平差异,揭示血浆TMAO水平与肠道菌群可能存在的相关关系,并为将来的进一步研究建立理论依据及实验基础。研究方法本病例对照研究连续纳入了从2014年2月至2015年2月入住南方医院神经内科的急性脑卒中/TIA患者。初步纳入的患者将根据纳入和排除标准严格筛选合格病例,最终诊断为急性缺血性脑卒中,且TOAST分型为LAA的患者将进入后续分析；而最终诊断为TIA,且有明确颅内外动脉粥样硬化斑块的患者也将纳入后续分析。结合各项临床数据证实与AS无关的缺血性脑卒中(如心源性等)和无明显颅内外AS斑块证据的TIA患者将被剔除。对照组参与者来源于在南方医院进行健康体检的人群,对照组人群均己完善颈动脉彩超(CDFI)、经颅彩色多普勒(TCD)和超声心动图(UCG)等检查。所有患者均采集了入院后的首个空腹血液样本(使用EDTA抗凝采血管)及入院48小时内的首个粪便样本。对照组人群收集其体检当天的空腹血样及粪便样本。所有血液样本收集后,在低温下运送至实验室,然后在4℃,3000转／分钟下低温离心10分钟,随后抽取上清(血浆)冻存于-80℃。所有新鲜采集的粪便样本将及时冻存于-80℃,直至进行后续实验。粪便样本总DNA(肠道菌群总DNA)将严格根据说明书使用MOBIO强力土壤DNA提取试剂盒(MOBIO)进行提取。所获得的DNA产物及时冻存于-20℃以备后期进行PCR扩增使用。在获得肠道菌群总DNA产物后,我们以16srRNA V4可变区域带barcode的通用引物进行PCR扩增,本研究所用上游引物是514F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA),下游引物是805R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。在获得PCR产物后,我们将抽取少量产物进行跑胶以确定获得目标条带(提示DNA扩增成功)。最终,所有的PCR产物经定量混合后,统一送至华大基因公司(深圳,中国)进行测序。测序方法采用Illumina Miseq (PE 150)测序技术。在测序前原始序列将利用BIPES技术进行预处理。在获得肠道菌群总DNA测序结果后,我们使用QIIME(1.8.0)进行了肠道菌群的基础分析。利用Usearch算法(Usearch algorithm)所有的序列被归类为OTUs。OTU (Operational Taxonomic Units,分类操作单元)是人为的在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,给某一个分类单元(品系,种,属,分组等)设置的同一标志。在生物学信息分析中,一般来说,测序得到的每一条序列来自一个菌。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息,就需要对序列进行归类操作(cluster)。通过归类操作,将序列按照彼此的相似性分归为许多小组,一个小组就是一个OTU,或者说一个OTU代表一种细菌。通常在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。每个OTU的代表性序列根据序列的频率进行确定；代表序列利用PyNAST算法(PyNAST algorithms)进行校准排齐处理；将去除嵌合体后的OTU中的代表序列插入FastTree软件中,以生成所有OTU代表序列的系统发育进化树,并在此基础上进行a-和β-多样性分析。根据OTU数据的特点,随机森林分类模型利用R软件包来分类来自患者和健康对照的样本。为了确定LAA/TIA患者和对照组具有显著差异的细菌类群,我们在两组间进行了LEfSe (linear discriminate analysis size effect)分析以比较两组间的菌群差异。在本次分析中,我们将LDA (linear discriminate analysis,线性判别分析)临界值设置为3。在进行TMAO检测前,所有血浆样本均保持在-80℃环境下冻存。血浆TMAO测定采用克利夫兰医学中心研究人员建立的稳定同位素稀释液相色谱质谱联用技术(LC-MS) (6,460 Series Triple Quadrupole LC/MS, Agilent, USA)进行定量检测。统计学分析利用R(3.0.2)完成。在本研究中,各项纳入研究指标均因未能同时符合Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐性检验,故我们采用非参数检验(Wilcoxon秩和检验方法或Kruskal Wallis秩和检验方法)来对两组及多组间的数据进行统计分析,成对样本则用Nemenyi检验法。分类变量采用卡方检验。由于微生物组数据的多维性,我们在QIIME 1.8.0平台上进行微生物组的Adonis检验。P<0.05表示有统计学意义。结果在本研究中,最终共有435名急性缺血性脑卒中/TIA患者被初步纳入研究,经过后期的筛选(严格执行纳入及排除标准),最终有322名LAA/TIA患者符合纳入标准。所有322名患者均采集了入院后首个空腹血浆样本,其中141名患者在入院48小时内留取了合格的粪便样本。对照组最终纳入了符合入组条件的231名体检者,其中97名对照组人员于体检当天留取了合格的新鲜粪便样本。首先,我们根据对照组颈动脉彩超结果是否存在AS改变将对照组分为3个亚组：明确存在颈AS斑块形成组(AS亚组)、颈动脉内膜中层厚度(intima-media thickness)增加组(IMT亚组)及未发现明显AS改变组(Non-AS亚组)。我们分析比较了对照组三个亚组间的血浆TMAO水平及肠道菌群,结果表明,三组间血浆TMAO水平及肠道菌群均未见显著性差异。上述分析结果说明,在正常对照组中,AS与肠道菌群结构和血浆TMAO水平均未见明显的统计学相关关系。然而,无论是利用传统的PCoA (principal coordinate analysis,主坐标分析)分析法,还是基于随机森林算法的机器学习分析法,LAA/TIA患者组(疾病组)的肠道菌群结构则表现出了明显不同于对照组的肠道菌群结构。其中,α-多样性分析表明疾病组具有较对照组明显多样化的肠道菌群。基于未加权的UniFrac距离分析,我们发现相比于Non-AS和IMT组,对照组AS亚组的肠道菌群结构已经表现出了倾向于类似LAA/TIA患者肠道菌群失衡改变的趋势。这个结果说明,对照组AS亚组的肠道菌群结构已经出现了轻度的紊乱表现,且这种紊乱与疾病组相似。另外,LEfSe分析表明,疾病组患者肠道菌群含有更多的机会致病菌(有害菌),如肠杆菌属、巨型球菌属、脱硫弧菌属等,而被广泛认可的有益菌如拟杆菌属、普氏菌属和柔嫩梭菌属含量明显下降。且这种菌群紊乱的改变在卒中较为严重的患者中更加明显。与此同时,通过检测两组人群的血浆TMAO水平,我们发现,与预期的结果相反,LAA/TIA患者血浆TMAO水平非但没有出现升高,反而出现了较对照组显著下降的现象(P<0.05)。结论LAA/TIA患者与对照组相比出现了明显的肠道菌群紊乱的表现,其肠道菌群有害菌比例升高,而有益菌含量较对照组明显降低；且疾病组血浆TMAO水平明显低于对照组。